Selective damage of human leukemia cells can be achieved through a novel approach of applying low frequency ultrasound both with and without chemotherapeutic pretreatment of leukemic and normal hematopoietic cells.
Low frequency ultrasound in the 20 to 60 kHz range is a novel physical modality by which to induce selective cell lysis and death in neoplastic cells. In addition, this method can be used in combination with specialized agents known as sonosensitizers to increase the extent of preferential damage exerted by ultrasound against neoplastic cells, an approach referred to as sonodynamic therapy (SDT). The methodology for generating and applying low frequency ultrasound in a preclinical in vitro setting is presented to demonstrate that reproducible cell destruction can be attained in order to examine and compare the effects of sonication on neoplastic and normal cells. This offers a means by which to reliably sonicate neoplastic cells at a level of consistency required for preclinical therapeutic assessment. In addition, the effects of cholesterol-depleting and cytoskeletal-directed agents on potentiating ultrasonic sensitivity in neoplastic cells are discussed in order to elaborate on mechanisms of action conducive to sonochemotherapeutic approaches.
超音波は、人間の聴覚能力(〜20キロヘルツ)1の上限値よりも高い周波数を有する任意の振動音圧の波を指します。 20〜60 kHzの範囲の低周波の超音波は、核酸抽出のため、組織破壊のため、および他の試験の様々な細胞のサンプルを調製し、エマルションを生成する手段として研究室で利用されています。低周波超音波のユーティリティは、様々な材料を洗浄、溶接のための工業環境に拡張し、材料加工に採用されています。市販の超音波発生器は100-1,200 Wからワット数を18〜60 kHzの範囲の周波数に来て、フルスケール
超音波は、長い画像診断のための臨床設定で使用されてきたが、それはごく最近の治療法として適用されています。超音波≥1MHzのは、安全に目に尿路結石(腎臓結石)と胆管結石(石を破壊することが可能です症状2,3を減らすために、患者の電子の胆嚢や肝臓で)。体外衝撃波砕石術(ESWL)と呼ばれるこの手法は、現在広くクリニック(百万人以上の患者が米国だけでESWLで毎年4に処理されます)に適用され、モダリティを提供していますそれによって非侵襲的に結石を破壊され、外部から印加され、集中し、高強度の音響パルス2-4を使用することにより、最小限の付随的な損傷。
これにより、高強度の超音波によって生成される一意の直接剪断力、ならびにキャビテーション気泡に、これらの方法は、高強度として知られている手法では去勢抵抗性前立腺癌および膵臓腺癌の治療のための癌治療において検討されているが、集束超音波(HIFU )5-8。 ESWLと非常に類似した方法では、HIFUは、複数の超音波ビームを使用し、60°CまたはHIGの温度を生成するために、選択された焦点領域上に焦点を合わせます標的組織5で凝固壊死を誘導する音響エネルギーの使用を介して彼女の、。熱アブレーションの他のモダリティは、現在(高周波アブレーションおよびマイクロ波切除)が存在するが、HIFUは、それが唯一の非侵襲性の高体温モダリティ5であることを、これらの方法に比べて明らかな利点を提供しています。 HIFUは、診療所での混合の結果を達成し、現在臨床試験8-11でのみ使用することができました。それにもかかわらず、限られた成功は、それを実現しており、前臨床モデル哺乳動物から取得された生体内データにおける非常に有望な癌治療における超音波の可能性を実証しました。
HIFUを改善するために、研究者はsonochemotherapyのフォームを生成するために、適切な抗悪性腫瘍剤で超音波を結合しようとしました。音響化学療法(SDT)は、インビトロでの印象的な抗新生物活性を示した有望な新規な治療法であり、 <em> in vivo試験1。そのような細胞および正常組織学的1,5のものとの間のサイズの差に基づいて、優先的に悪性細胞損傷を、その超音波が示されています。 SDTは、腫瘍細胞に対して、超音波によって及ぼさ優先損傷の程度を増加させるためのsonosensitizersとして知られる特殊な薬剤を搭載しています。 SDTの治療用途は、以前に検討されているが、使用される超音波システムは、典型的には、より高い周波数の超音波(≥1MHz)を採用し、低kHzの周波数の超音波の効果はまだ十分に探求されなければなりません。超音波の周波数が低い慣性キャビテーション、物理化学的ダメージ12-14の誘導、マイクロバブルの急速な崩壊に起因する細胞の破壊をもたらす現象を生産で多くの場合、より精通しています。 MHzおよび低kHzの超音波との間の慣性キャビテーションの発生の差が低い波周波数はマイクロバブルを有効にするという事実に起因していますその結果、以下の圧縮半サイクル12の間に、より暴力的な崩壊を生成する、拡張半サイクルにおいて整流拡散によって成長する多くの時間です。
我々は以前U937ヒト単球性白血病細胞は、低周波超音波(23.5キロヘルツ)に敏感であり、この感度は著しく細胞骨格15を乱す抗腫瘍剤を適用することにより増加させることができることを示しています。さらに、我々は、大きなセルは、より高い音波感受性を示すと、細胞が優先的サイズに基づいて、破損していることを実証しました。加えて、同程度の細胞サイズで正常なヒト造血幹細胞(hHSCs)および白血球仮低周波超音波を優先正常組織の存在下で悪性細胞を損傷するために使用され得ることを示唆し、その新生物の対応15より超音波処理に非常に耐性が高いです。
さらにユニークな小道具を調べるために、潜在的な治療に使用するための低周波超音波のertiesは、我々は、我々の現在の超音波処理システムのいずれかの有効性と信頼性を高めるために取り付けられた20ミリメートルのホーンを搭載したブランソンモデルSLPe 150 W、40 kHzの細胞破砕を、洗浄および安定化手順を開発しました7.62センチメートルカップに。さらに、我々はハイドロホンとキャビテーションメーターとオシロスコープを使用して、40 kHzの範囲内で正確なサンプルキャビテーションエネルギーだけでなく、一貫性のある波形と振幅を決定することができました。精錬と私たちのプロトコルを体系によって、我々は、私たちは定量的に異なるhistogenetic系統の腫瘍性および正常細胞の音波感度を比較することができ、我々の実験超音波処理の一貫性を確立することができました。 40 kHzのシステムのための我々のプロトコルは、関心のある研究室は、同程度の実験を行うことができるように、および抗腫瘍によって誘発効果の調査結果を評価するために広範に詳細に示されています低周波超音波。 (; 図1MeβCD)、コレステロール除去剤、U937の超音波感受性およびTHP1ヒト単球性白血病細胞を増加させることに加えて、我々はメチルβシクロデキストリンの用量依存的効果を調べます。
最適な結果を達成するために、特別なケアは慎重にサンプルを配置し、コンバータ·ホーン組合をきれいにするために取られるべきです。ホーンのサンプルの配置は、ホーンからの距離を変更すると、音響焦点を変化させ、したがって、サンプルがさらされるエネルギーを変化させるように、一貫性の細胞破壊を得るために重要です。カップホーン内の音響エネルギーは、最大キャビテーションの位置を見つけるために、キャビテーションメーターを用いてマッピングすることができます。また、キャビテーションメーター、オシロスコープと一緒に細胞がさらされている音の強さを決定するために不可欠であるだけでなく、波形の均一性。したがって、これらの機器は、システムに問題を検出し、トラブルシューティングは、システムの不安定性を修正するために必要とされるかもしれないものを判断するために使用されるべきです。
前述のように、低周波数システムは、実験を通して、さらに脱ガスに水を作用していない場合のために実行することができます超音波処理をサンプリングする前に数分。この最初の実行では、実験中に比較的脱気した超音波処理媒体ため、一貫性のある結果を得るために行われなければなりません。 sonosensitizersの有効性を評価する際の感作の真の程度が評価するのは困難であるように加えて、細胞は、最大振幅またはその近くで超音波処理されるべきではありません。 40 kHzのシステム上で33%の振幅を使用すると、それが顕著な損傷を生成するように、理想的な設定ですが、U937及びTHP1細胞( 図7)に対してMeβCDで示されたように、その有効性を実証するためにsonosensitizers十分な余地を提供します。これらのデータはまたMeβCDが用量依存的に低周波の超音波の多重白血病株を感作することを確認します。
超音波処理17-19を介して生成された膜内キャビテーション気泡の証拠を示す8 MHzに0.75メガヘルツの範囲でより高い周波数で行われた実験の数がありました。しかし、questioまだ超音波によって誘導される細胞溶解18の正確なメカニズムに関しては残るNS。我々は細胞骨格を流動化し、低周波超音波15、他の研究室20,21によって実証現象を利用して音波の感度を増加させたとの間のリンクを示している。また、我々は、サイトカラシンBのようなマイクロフィラメント、破壊剤は、複数の白血病での超音波の感度を増強することを発見しましたアクチン重合の阻害を示唆する線ではなく、hHSCsまたは22の白血球は、特に関心のsonosensitizing機構であってもよいです。またビンクリスチン、チューブリン重合を阻害する23微小管破壊剤、24は 、顕著に急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病を含む、 インビトロでの異なるタイプの白血病の超音波感受性を増加させることを観察しました。これとは対照的に、細胞骨格成分を安定化させる細胞骨格指向剤(パクリタキセルANDのジャスプラキノリド)は、細胞溶解22の下率で反射された、超音波処理に細胞が耐性にするように見えます。まとめると、これらのデータは、腫瘍細胞の細胞骨格成分を流動化することは、実際にSDT 25の効率を向上させる上で重要な因子であるという仮説を支持します。本研究はまた、コレステロール枯渇はMeβCD処理したU937細胞が著しく40 kHzの超音波に感作されているように、さらに、新生物細胞の超音波感受性を増強するすることにより、別の方法であってもよいことを示しています。
当社の超音波処理プロトコルは、in vitroで顕著な抗新生物活性を示しているが、現在の方法論は、文化や超音波処理のために使用バイアルに適合することができる小型の脊椎動物のモデルで動作するように制限されています。我々は、安全に、パルスの低周波超音波(20キロヘルツ)を用いて超音波処理することができることを示しているゼブラフィッシュ、および化学療法剤に対する耐性は、定量的に同等であることを担癌ゼブラフィッシュは、これらのプロトコルのインビボ抗腫瘍活性を評価する予備研究において使用され得ることを示唆しているマウスモデル26によって許容用量。それにもかかわらず、前の哺乳動物モデルの超音波処理に化学療法剤を投与するMHzの範囲1に報告されており、このようなプロトコルは、おそらく、低周波超音波、ならびにコレステロール枯渇および細胞骨格指向剤を組み込むように拡張することができます。
SDTのこの形式の潜在的な臨床応用は、従来の超音波処理25のために除去された血液に(iv)の抗腫瘍剤を静脈内に投与された体外血液超音波処理を含むことができます。この方法は、人体の解剖学的構造によってもたらされる潜在的な音の障壁を除去し、固形腫瘍から白血病性芽球、ならびに転移を損傷する効果的な方法かもしれません。これは、コレステロール枯渇および細胞骨格指向剤は可能性もあります既にこの治療法の有効性を改善する試みにおいて、臨床において検討されているHIFUプロトコルにおいて使用されます。
本研究に記載された方法は、潜在的なsonosensitizersの価値を評価することが可能で、さらにシステムの改良は、このユーティリティを高めることができます。しかし、電源品質、音響焦点、およびコンバータの個体ばらつきを含む超音波クレビスを使用する際に考慮すべき多くの変数があります。そのため、今後の研究は音波を可視化し、その結果に及ぼす影響を理解することに焦点を当てます。 SDTは、 インビトロで細胞溶解を増強することが示されており、哺乳動物モデルにおけるインビボでの多くのデータが取得された場合、臨床的に実行可能なことが判明し得ます。複数のエージェントおよび超音波を伴う悪性細胞の他の潜在的に悪用可能な特性、ならびに種々の複合モダリティを調べる実験では、我々の研究室で継続します。
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank the staff of the Syracuse University Department of Physics workshop for their innovative assistance in matters relating to our system design.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium w/ NaHCO3 & 25mM Hepes | Life Technologies | 12440079 | |
Amphotericin B Solution | Sigma-Aldrich | A2942 | |
Penicillin/Streptomycin 100x Solution | Life Technologies | 10378-016 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12105 | |
Branson SLPe 40kHz Cell Disruptor with 3" (25mm) Cuphorn | Branson Ultrasonics | 101-063-726 | sonication device |
Brisk Heat SDC Benchtop Digital temperature Controler w/ 1000mL Beaker Heater | Brisk Heat | SDCJF1A-GBH1000-1 | heater used for temperature control |
Beckman-Coulter Z2 Cell Sizer with AccuComp® Software | Beckman-Coulter | 6605700 | |
Bio-Rad TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 145-0102 | |
Gentamicin 50mg/mL | Sigma-Aldrich | G1397 | |
Trypan Blue Solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
Falcon 50mL & 25mL Vented Culture Flasks | Fisher Scientific | 353082 | |
Lonza L-Glutamine 200mM 0.85% NaCl | Lonza | 17-605C | |
Seal-Rite 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1615-5510 | |
Beckman-Coulter Accuvette ST 25mL Vials and caps | Beckman-Coulter | A35473 | |
AccuJet Pro Auto Pipet | BrandTech Scientific | 26330 | |
USA Scientific 10mL Disposable Serological Pipets | USA Scientific | 1071-0810 | |
Tip One 100uL and 1000uL Filter Tips | USA Scientific | 1120-1840, 1126-7810 | |
100uL Micropipette | Wheaton | 851164 | |
1000uL Micropipette | Wheaton | 851168 | |
BioRad Dual Chamber Counting Slides | Bio-Rad | 145-0015 | |
Forma Scientific Dual chamber water jacketed Incubator | Forma Scientific | 3131 | |
Tektronix DPO 2002B Digital Phosphor Oscilloscope | Tektronix | DPO2002B | used to measure the ultrasonic waveform |
PPB MegaSonics Model PB-500 Ultrasonic Energy Meter | PPB Megasonics | PB-500 | used to assess the sound intensity in W/cm2 |
Teledyne RESON TC4013-1 Hydrophone | Teledyne | TC4013-1 | connects to the oscilloscope |
Wheaton 250mL Flasks | Sigma-Aldrich | Z364827 | |
20mL Glass Scintillation Vials | Sigma-Aldrich | Z190527 | |
Beckman-Coulter Isotonic Saline Solution | Beckman-Coulter | N/A | diluent for Z2 counter |
Chloroform 99% | Sigma-Aldrich | C2432 | |
Ethanol 200 Proof Anhydrous | Sigma-Aldrich | 459836 | |
Mineral Oil | N/A | ||
XTT Cell Proliferation Assay Kit | ATCC | 30-1011K | |
96-Well Microplate Reader | Cole-Palmer | EW-13055-54 | |
U937 Human Monocytic Leukemia Cells | ATCC | CRL1593.2 | |
THP1 Human Monocytic Leukemia Cells | ATCC | TIB-202 |