Selective damage of human leukemia cells can be achieved through a novel approach of applying low frequency ultrasound both with and without chemotherapeutic pretreatment of leukemic and normal hematopoietic cells.
Low frequency ultrasound in the 20 to 60 kHz range is a novel physical modality by which to induce selective cell lysis and death in neoplastic cells. In addition, this method can be used in combination with specialized agents known as sonosensitizers to increase the extent of preferential damage exerted by ultrasound against neoplastic cells, an approach referred to as sonodynamic therapy (SDT). The methodology for generating and applying low frequency ultrasound in a preclinical in vitro setting is presented to demonstrate that reproducible cell destruction can be attained in order to examine and compare the effects of sonication on neoplastic and normal cells. This offers a means by which to reliably sonicate neoplastic cells at a level of consistency required for preclinical therapeutic assessment. In addition, the effects of cholesterol-depleting and cytoskeletal-directed agents on potentiating ultrasonic sensitivity in neoplastic cells are discussed in order to elaborate on mechanisms of action conducive to sonochemotherapeutic approaches.
Ultrasound verwijst naar elke oscillerende geluidsdrukgolf met een frequentie hoger dan de bovengrens van het menselijk oor capaciteit (~ 20 kHz) 1. Laagfrequente ultrageluid in de 20-60 kHz is gebruikt in het laboratorium voor de opwekking van emulsies, voorbereiding celmonsters voor nucleïnezuurextractie voor weefselontwrichting, en voor verschillende andere tests. Het nut van laagfrequente ultrageluid is ook uitgebreid om de industriële omgeving voor het lassen, het reinigen diverse materialen, en materialen verwerken. In de handel verkrijgbare echografie generatoren komen frequenties variërend 18-60 kHz, en full-scale wattages van 100-1200 W.
Hoewel ultrasound lang gebruikt in de klinische setting voor diagnostische beeldvorming, is toegepast als therapeutische modaliteit onlangs. Echografie ≥1 MHz in staat is veilig verstoren urinewegen (nierstenen) en gal calculi (stenen in the galblaas of de lever) bij patiënten met symptomen 2,3 verminderen. Deze benadering bekend als extracorporale schokgolf lithotripsie (ESWL) wordt nu algemeen toegepast in de kliniek (meer dan een miljoen patiënten per jaar behandeld met ESWL in de Verenigde Staten alleen 4), en biedt een modaliteit waarmee op niet-invasieve breken met calculi minimale bijkomende schade door het gebruik van uitwendig aangelegde, geconcentreerd, hoge intensiteit akoestische pulsen 2-4.
Door de unieke directe afschuifkrachten, alsmede cavitatiebellen gegenereerd door een hoge intensiteit ultrageluid, zijn deze methodieken in kankertherapie onderzocht voor de behandeling van castratieresistente prostaatcarcinoom en pancreas adenocarcinoom in een benadering bekend als high intensity focused ultrasound (HIFU ) 5-8. Op een wijze vergelijkbaar met ESWL, HIFU gebruikt meerdere ultrageluidbundels en richt ze op een geselecteerde concentratiegebied aan temperaturen van 60 ° C of hig genererenhaar door het gebruik van akoestische energie, coagulatieve necrose induceren in het doelweefsel 5. Hoewel andere modaliteiten thermische ablatie momenteel bestaan (radiofrequente ablatie en microgolf ablatie), HIFU biedt een duidelijk voordeel ten opzichte van deze methoden, dat is de enige niet-invasieve hyperthermisch modaliteit 5. HIFU heeft bereikt gemengde resultaten in de kliniek en is momenteel alleen beschikbaar in klinische studies 8-11. Niettemin hebben het beperkte succes dat heeft bereikt, en de veelbelovende in vivo data verkregen van preklinische zoogdieren modellen van het potentieel van ultrageluid in de behandeling van kanker aangetoond.
In een poging om HIFU verbeteren hebben onderzoekers geprobeerd om ultrageluid te combineren met geschikte antineoplastische middelen een vorm van sonochemotherapy genereren. Sonodynamic therapie (SDT) is een veelbelovende nieuwe behandeling modaliteit heeft aangetoond indrukwekkende antineoplastische activiteit in zowel in vitro en <em> In vivo studies 1. Het is aangetoond dat ultrageluid voorkeur schade kwaadaardige cellen op basis van het verschil grootte tussen dergelijke cellen en die van normale histologie 1,5. SDT bevat gespecialiseerde agenten bekend als sonosensitizers om de omvang van de preferentiële schade die wordt uitgeoefend door ultrageluid tegen neoplastische cellen te verhogen. Terwijl therapeutische toepassingen van SDT eerder zijn onderzocht, ultrasone systemen maken gebruik doorgaans hogere frequentie ultrageluid (≥1 MHz), en de gevolgen van lage kHz ultrasone trillingen is nog niet volledig onderzocht. Lagere frequenties van ultrageluid worden vaak bedreven in het produceren inertiale cavitatie, een verschijnsel dat resulteert in de vernietiging van de cellen door de snelle instorten microbellen induceren fysicochemische schade 14/12. Dit verschil in de vorming van inertiale cavitatie tussen MHz en lage kHz ultrasound is toegeschreven aan het feit dat lagere golffrequenties mogelijk microbelletjesis meer tijd om te groeien door verholpen diffusie in de uitbreiding halve cyclus, dus het produceren van meer gewelddadige instortingen tijdens de volgende compressie halve cyclus 12.
We hebben eerder aangetoond dat U937 humane monocytische leukemie cellen zijn gevoelig voor lage frequenties ultrageluid (23,5 kHz) en dat deze gevoeligheid sterk kan worden verhoogd door toepassing van taxanen die het cytoskelet 15 verstoren. Verder hebben we aangetoond dat cellen worden beschadigd bij voorkeur op basis van grootte, met grotere cellen vertonen hogere ultrasone gevoeligheid. Daarnaast normale humane hematopoïetische stamcellen (hHSCs) en leukocyten bij vergelijkbare celgrootte zijn veel beter bestand tegen sonicatie dan hun tegenhangers neoplastische 15, voorlopig suggereert dat lage frequentie ultrageluid kan worden gebruikt om bij voorkeur beschadigen kwaadaardige cellen in de aanwezigheid van normaal weefsel.
Om verder te onderzoeken van de unieke propschappen laagfrequent ultrageluid voor potentiële therapeutische toepassing hebben we het schoonmaken en stabilisatie procedures ontwikkeld om de effectiviteit en de betrouwbaarheid van één van de huidige sonicatie leiden en zo de Branson Model SLPe 150 W, 40 kHz Cell Disrupter, uitgerust met een 20 mm hoorn aangebracht in een 7,62 cm cup. Verder zijn we in staat om nauwkeurige sample cavitatie energieën en samenhangende golfvormen en amplitude binnen het 40 kHz met een cavitatie meter en oscilloscoop hydrofoon was bepaald. Door raffinage en systematiseren onze protocollen, zijn we in staat om de consistentie te vestigen in onze experimentele sonicaties, waardoor we kwantitatief vergelijken de sonische gevoeligheden van neoplastische en normale cellen van verschillende histogenetic geslachten geweest. Ons protocol voor de 40 kHz-systeem wordt gepresenteerd in uitgebreide detail om voor geïnteresseerde laboratoria in staat zijn van het uitvoeren van vergelijkbare experimenten, en onze bevindingen van de antineoplastische effecten uitgelokt door te evaluerenlage frequentie echografie. Verder wordt ingegaan op de dosisafhankelijke effecten van methyl-β-cyclodextrine (MeβCD Figuur 1), een cholesterol-afbrekende middel, op een verbeterde ultrasone gevoeligheid van U937 en THP1 humane monocytische leukemiecellen.
Om optimale resultaten te bereiken, moet bijzondere zorg worden genomen om zorgvuldig te positioneren het monster en het reinigen van de converter-hoorn unie. De plaatsing van het monster in de hoorn is belangrijk voor het verkrijgen van consistente celdestructie, het veranderen van de afstand tussen de hoorn de akoestische foci wijzigen en derhalve de energie het monster bloot te wijzigen. De akoestische energie in de beker hoorn kan worden toegewezen met de cavitatie meter om de positie van maximale cavitatie vinden. Bovendien, de cavitatie meter, samen met de oscilloscoop zijn essentieel voor het bepalen van de geluidsintensiteit de cellen worden blootgesteld, en de homogeniteit van de golfvorm. Daarom dienen deze instrumenten worden gebruikt om problemen te ontdekken met het systeem, en te bepalen welke problemen kunnen nodig zijn om systeeminstabiliteit corrigeren.
Zoals eerder vermeld, kan de laagfrequente systeem gedurende het experiment als niet gedraaid treden verder ontgast waterenkele minuten voorafgaand aan sonicatie proeven. Deze eerste run moet worden uitgevoerd om een relatief ontgast sonicatie medium en dus consistente resultaten tijdens de experimenten opleveren. Bovendien moeten de cellen niet gesoniceerd op of nabij het maximum amplitude bij de beoordeling van de werkzaamheid van sonosensitizers, als ware omvang van sensibilisatie moeilijk te beoordelen zijn. Met 33% amplitude over het 40 kHz-systeem een ideale instelling waarbij produceert aanzienlijke schade, maar biedt sonosensitizers voldoende ruimte om de werkzaamheid aan te tonen, zoals aangetoond met MeβCD tegen U937 en THP1 cellen (figuur 7). Deze gegevens bevestigen ook dat MeβCD sensibiliseert meerdere leukemie lijnen laagfrequente ultrageluid op een dosisafhankelijke wijze.
Er zijn een aantal experimenten uitgevoerd met een hogere frequentie in het bereik van 0,75 MHz tot 8 MHz die tekenen van intramembrane cavitatiebubbels door middel van sonicatie 17-19 gegenereerd zijn. Echter, VRAGEnS nog met betrekking tot het exacte mechanisme van door ultrageluid geïnduceerde cellyse 18 blijven. We hebben een verband aangetoond tussen fluïdiseren het cytoskelet en verhoogde gevoeligheid sonic middels laagfrequente ultrageluid 15, een verschijnsel blijkt uit andere laboratoria 20, 21. Verder hebben we vastgesteld dat de gloeidraad verstoren middelen zoals cytochalasine B potentiëren ultrasone gevoeligheid in meerdere leukemie lijnen, maar niet hHSCs of leukocyten 22, hetgeen suggereert dat remming van actine polymerisatie kan een sonosensitizing mechanisme van bijzonder belang. We hebben ook waargenomen dat vincristine, een microtubule-verstorende middel dat tubulinepolymerisatie 23, 24 remt, aanzienlijk verhoogt de ultrasone gevoeligheid van verschillende types leukemie in vitro waaronder acute myeloïde leukemie, chronische myeloïde leukemie en acute lymfatische leukemie. Daarentegen-cytoskelet gerichte middelen die cytoskelet componenten stabiliseren (paclitaxel eend jasplakinolide) lijken cellen resistent tegen sonicatie, weerspiegeld door de lagere tarieven van cellysis 22 te maken. Tezamen ondersteunen deze gegevens de hypothese dat het cytoskelet componenten van neoplastische cellen fluïdiserende inderdaad een belangrijke factor bij het vergroten van de effectiviteit van SDT 25. De onderhavige studie toont ook aan dat cholesterol depletie andere methode om verder te versterken de ultrasone gevoeligheid van neoplastische cellen, MeβCD behandelde U937 cellen aanzienlijk gevoelig zijn voor 40 kHz ultrageluid kan zijn.
Terwijl onze sonicatie protocollen aanzienlijke antineoplastische activiteit in vitro hebben aangetoond, is de huidige methode voor werk dat in cultuur kleine vertebrate modellen die kunnen passen in de flesjes voor ultrasoonapparaat zijn. We hebben aangetoond dat zebravis veilig worden gesonificeerd met behulp van gepulseerde lage ultrasone trillingen (20 kHz) en dat de tolerantie voor chemotherapeutische middelen kwantitatief vergelijkbaardoses getolereerd door knaagdiermodellen 26, wat suggereert dat tumordragende zebravis worden gebruikt vooronderzoek de in vivo antineoplastische activiteit van deze protocols evalueren. Niettemin toedienen chemotherapeutische middelen voorafgaand aan sonicatie van Zoogdiermodellen gerapporteerd in de 1 MHz, en dergelijke protocollen kan waarschijnlijk worden uitgebreid tot lage frequenties ultrageluid, en cholesterol kunnen aantasten en cytoskelet gerichte middelen bevatten.
Potentiële klinische toepassingen van deze vorm van SDT kunnen extracorporele bloed sonicatie waarin taxanen intraveneus toegediend (iv) voorafgaand aan het bloed worden verwijderd ultrasoonapparaat 25 omvatten. Deze methode verwijdert mogelijke geluidsschermen's van menselijke anatomie, en kunnen een effectieve manier om leukemische ontploffing, alsook metastasen beschadigen van vaste tumoren. Het is ook mogelijk dat cholesterol-aantasten en cytoskelet gerichte middelen kunnenworden gebruikt HIFU protocollen die reeds in de kliniek onderzocht in een poging om de werkzaamheid van deze behandelingsmodaliteit te verbeteren.
De in deze studie beschreven methoden zijn in staat van de beoordeling van de waarde van de potentiële sonosensitizers, en verder het systeem verfijning kan dit hulpprogramma verbeteren. Er zijn echter vele variabelen te overwegen bij het gebruik van dergelijke ultrasone inrichtingen, inclusief voeding kwaliteit, akoestische foci en variaties tussen converters. Daarom zal toekomstig onderzoek zich richten op het visualiseren van de geluidsgolven en het begrijpen van hun invloed op de resultaten. SDT heeft aangetoond dat cellysis in vitro te versterken en kan blijken klinisch haalbaar als meer in vivo data in zoogdierlijke modellen verkregen worden. Experimenten om andere potentieel bruikbare kenmerken van kwaadaardige cellen, en verschillende gecombineerde modaliteiten waarbij meerdere agentia en ultrageluid verder in ons laboratorium.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank the staff of the Syracuse University Department of Physics workshop for their innovative assistance in matters relating to our system design.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium w/ NaHCO3 & 25mM Hepes | Life Technologies | 12440079 | |
Amphotericin B Solution | Sigma-Aldrich | A2942 | |
Penicillin/Streptomycin 100x Solution | Life Technologies | 10378-016 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12105 | |
Branson SLPe 40kHz Cell Disruptor with 3" (25mm) Cuphorn | Branson Ultrasonics | 101-063-726 | sonication device |
Brisk Heat SDC Benchtop Digital temperature Controler w/ 1000mL Beaker Heater | Brisk Heat | SDCJF1A-GBH1000-1 | heater used for temperature control |
Beckman-Coulter Z2 Cell Sizer with AccuComp® Software | Beckman-Coulter | 6605700 | |
Bio-Rad TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 145-0102 | |
Gentamicin 50mg/mL | Sigma-Aldrich | G1397 | |
Trypan Blue Solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
Falcon 50mL & 25mL Vented Culture Flasks | Fisher Scientific | 353082 | |
Lonza L-Glutamine 200mM 0.85% NaCl | Lonza | 17-605C | |
Seal-Rite 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1615-5510 | |
Beckman-Coulter Accuvette ST 25mL Vials and caps | Beckman-Coulter | A35473 | |
AccuJet Pro Auto Pipet | BrandTech Scientific | 26330 | |
USA Scientific 10mL Disposable Serological Pipets | USA Scientific | 1071-0810 | |
Tip One 100uL and 1000uL Filter Tips | USA Scientific | 1120-1840, 1126-7810 | |
100uL Micropipette | Wheaton | 851164 | |
1000uL Micropipette | Wheaton | 851168 | |
BioRad Dual Chamber Counting Slides | Bio-Rad | 145-0015 | |
Forma Scientific Dual chamber water jacketed Incubator | Forma Scientific | 3131 | |
Tektronix DPO 2002B Digital Phosphor Oscilloscope | Tektronix | DPO2002B | used to measure the ultrasonic waveform |
PPB MegaSonics Model PB-500 Ultrasonic Energy Meter | PPB Megasonics | PB-500 | used to assess the sound intensity in W/cm2 |
Teledyne RESON TC4013-1 Hydrophone | Teledyne | TC4013-1 | connects to the oscilloscope |
Wheaton 250mL Flasks | Sigma-Aldrich | Z364827 | |
20mL Glass Scintillation Vials | Sigma-Aldrich | Z190527 | |
Beckman-Coulter Isotonic Saline Solution | Beckman-Coulter | N/A | diluent for Z2 counter |
Chloroform 99% | Sigma-Aldrich | C2432 | |
Ethanol 200 Proof Anhydrous | Sigma-Aldrich | 459836 | |
Mineral Oil | N/A | ||
XTT Cell Proliferation Assay Kit | ATCC | 30-1011K | |
96-Well Microplate Reader | Cole-Palmer | EW-13055-54 | |
U937 Human Monocytic Leukemia Cells | ATCC | CRL1593.2 | |
THP1 Human Monocytic Leukemia Cells | ATCC | TIB-202 |