Selective damage of human leukemia cells can be achieved through a novel approach of applying low frequency ultrasound both with and without chemotherapeutic pretreatment of leukemic and normal hematopoietic cells.
Low frequency ultrasound in the 20 to 60 kHz range is a novel physical modality by which to induce selective cell lysis and death in neoplastic cells. In addition, this method can be used in combination with specialized agents known as sonosensitizers to increase the extent of preferential damage exerted by ultrasound against neoplastic cells, an approach referred to as sonodynamic therapy (SDT). The methodology for generating and applying low frequency ultrasound in a preclinical in vitro setting is presented to demonstrate that reproducible cell destruction can be attained in order to examine and compare the effects of sonication on neoplastic and normal cells. This offers a means by which to reliably sonicate neoplastic cells at a level of consistency required for preclinical therapeutic assessment. In addition, the effects of cholesterol-depleting and cytoskeletal-directed agents on potentiating ultrasonic sensitivity in neoplastic cells are discussed in order to elaborate on mechanisms of action conducive to sonochemotherapeutic approaches.
Ultralyd henviser til enhver oscillerende lydtryk bølge med en frekvens større end den øvre grænse af humane auditive kapaciteter (~ 20 kHz) 1. Lavfrekvente ultralyd i 20-60 kHz er blevet anvendt i laboratoriet som et middel til emulsioner, forberedelse celleprøver for nukleinsyre ekstraktion, for vævsødelæggelse, og for en række andre tests. Anvendeligheden af lavfrekvente ultralyd er også blevet udvidet til den industrielle indstilling for svejsning, rensning af forskellige materialer, og i materialer forarbejdning. Kommercielt tilgængelige ultralyd generatorer kommer i frekvenser spænder fra 18 til 60 kHz, og fuld-skala wattager fra 100-1,200 W.
Selv om ultralyd længe har været anvendt i kliniske omgivelser til diagnostisk billeddannelse, er det blevet anvendt som et terapeutisk modalitet for nylig. Ultralyd ≥1 MHz er i stand til sikkert forstyrre urinvejssten (nyresten) og biliær calculi (sten i the galdeblæren eller leveren) i patienter for at reducere symptomerne 2,3. Denne fremgangsmåde er kendt som ekstrakorporal chokbølge litotripsi (ESWL) er nu almindeligt anvendt i klinikken (mere end en million patienter behandles årligt med ESWL i USA alene 4), og tilbyder en modalitet, som til ikke-invasivt bryde op calculi med minimal sikkerhedsstillelse skader ved brug af eksternt påført, fokuseret, høj intensitet akustiske impulser 2-4.
På grund af de unikke direkte forskydningskræfter, samt kavitationsbobler genereret af høj intensitet ultralyd, er disse metoder blevet undersøgt i cancer terapi til behandling af kastrationsresistent prostata carcinom og pancreas adenocarcinom i en tilgang kendt som høj intensitet fokuseret ultralyd (HIFU ) 5-8. På en måde meget lig ESWL bruger HIFU flere ultralyd bjælker og fokuserer dem på et udvalgt fokusområde at generere temperaturer på 60 ° C eller HIGhende gennem brug af akustisk energi, inducere koagulerede nekrose i målvævet 5. Selv om andre retningslinjer for termisk ablation øjeblikket findes (radiofrekvens ablation og mikrobølgeovn ablation), HIFU tilbyder en klar fordel i forhold disse metoder i, at det er den eneste ikke-invasiv hypertermisk modalitet 5. HIFU har opnået blandede resultater i klinikken og er i øjeblikket kun tilgængelig i kliniske forsøg 8-11. Ikke desto mindre har den begrænset succes, den har opnået, og den meget lovende in vivo data indhentet fra prækliniske pattedyr modeller demonstreret potentialet i ultralyd i kræftbehandling.
I et forsøg på at forbedre HIFU har forskere forsøgt at kombinere ultralyd med passende antineoplastiske midler til at generere en form for sonochemotherapy. Sonodynamic terapi (SDT) er en lovende ny behandling modalitet som har påvist imponerende antineoplastisk aktivitet i både in vitro og <em> In vivo studier 1. Det er blevet vist, at ultralyd fortrinsvis skader maligne celler baseret på størrelsen forskellen mellem sådanne celler og dem af normal histologi 1,5. SDT inkorporerer specialiserede agenter kendt som sonosensitizers at øge omfanget af præferentiel skader udøves af ultralyd mod neoplastiske celler. Mens terapeutiske anvendelser af SDT er tidligere blevet undersøgt, ultralyds systemer, der anvendes typisk anvender højere frekvens ultralyd (≥1 MHz), og virkningerne af lav kHz ultralyd har endnu ikke fuldt udforsket. Lavere frekvenser af ultralyd er ofte mere dygtige til at producere inertial kavitation, et fænomen, der resulterer i ødelæggelse af celler på grund af den hurtige sammenklapning af mikrobobler, inducere fysisk skade 12-14. Denne forskel i genereringen af inertial kavitation mellem MHz og lav kHz ultralyd er blevet tilskrevet det faktum, at lavere bølge frekvenser aktiverer mikrobobleer mere tid til at vokse med udbedret diffusion i ekspansion halvperiode dermed producerer mere voldelige kollapser løbet af det følgende kompression halvperiode 12.
Vi har tidligere vist, at U937 humane monocytiske leukæmiceller er følsomme over for lavfrekvente ultralyd (23,5 kHz), og at denne følsomhed kan markant forøget ved anvendelse af antineoplastiske midler, som forstyrrer cytoskelettet 15. Vi har desuden vist, at celler fortrinsvis er beskadiget baseret på størrelse, med større celler, der udviser højere ultralyd følsomhed. Desuden normale humane hæmatopoietiske stamceller (hHSC'er) og leukocytter ved sammenlignelig cellestørrelser er meget mere modstandsdygtige over for lydbehandling end deres neoplastiske modstykker 15, forsøgsvis antyder, at lavfrekvente ultralyd kan anvendes til fortrinsvis at ødelægge maligne celler i nærvær af normalt væv.
For yderligere at undersøge den unikke properties af lavfrekvent ultralyd til potentiel terapeutisk brug, har vi udviklet rengørings- og stabilisering procedurer for at øge effektiviteten og pålideligheden af en af vores nuværende sonikering systemer Branson Model SLPe 150 W, 40 kHz Cell Disrupter, er udstyret med en 20 mm horn monteret ind i en 7,62 cm kop. Derudover har vi været i stand til at bestemme nøjagtige prøve kavitation energier, samt konsistente kurver og amplitude inden for 40 kHz ved anvendelse af en kavitation meter og oscilloskop med hydrofon. Ved raffinering og systematisere vores protokoller, har vi været i stand til at etablere konsistens i vores eksperimentelle sonications, tillader os at kvantitativt sammenligne de soniske følsomhed neoplastiske og normale celler af forskellige histogenetic afstamninger. Vores protokol til 40 kHz-system præsenteres i omfattende detaljer, for at interesserede laboratorier til at være i stand til at udføre sammenlignelige eksperimenter, og vurdere vores resultater i de antineoplastiske virkninger fremkaldt aflavfrekvente ultralyd. Desuden undersøger vi den dosis-afhængige effekter af methyl-β-cyclodextrin (MeβCD, figur 1), en kolesterol-nedbrydende middel, om at øge ultralyd følsomhed U937 og THP1 humane monocytiske leukæmiceller.
For at opnå optimale resultater, skal der tages særlig omhu for at omhyggeligt placere prøven og rengør omformer-horn union. Placeringen af prøven i hornet er vigtig for at opnå ensartet destruktion celle, som vil ændre ændre afstanden fra hornet den akustiske foci, og derfor ændrer energien prøven udsættes for. Den akustiske energi inde i hætten horn kan kortlægges ved hjælp af kavitation måleren til at finde positionen med maksimal kavitation. Hertil kommer, at kavitation meter, sammen med oscilloskopet er afgørende for bestemmelse af lydintensitet cellerne bliver udsat for, samt homogeniteten af bølgeformen. Derfor bør disse instrumenter anvendes til at detektere problemer med systemet, og hjælpe med at bestemme, hvad fejlmelding kan være nødvendig for at korrigere systemet ustabilt.
Som tidligere nævnt kan den lavfrekvente systemet virke til yderligere afgasse vandet under hele eksperimentet, hvis ikke køre foradskillige minutter før prøve sonikering. Denne første kørsel skal udføres til opnåelse af en relativt afgasset sonikering medium og dermed ensartede resultater ved forsøg. Desuden bør celler ikke sonikeret ved eller nær den maksimale amplitude ved vurderingen af effektiviteten af sonosensitizers, som det sande omfang af overfølsomhed ville være vanskeligt at vurdere. Ved hjælp af 33% amplitude på 40 kHz-system er en ideel ramme, da det producerer bemærkelsesværdige skader, men giver sonosensitizers rigelig plads til at demonstrere deres effektivitet, som påvist med MeβCD mod U937 og THP1 celler (figur 7). Disse data bekræfter også, at MeβCD sensibiliserer flere leukæmi linjer til lavfrekvente ultralyd på en dosisafhængig måde.
Der har været en række forsøg gennemført med højere frekvens i området fra 0,75 MHz til 8 MHz, der viser tegn på intramembrane kavitationsbobler, der genereres gennem lydbehandling 17-19. Dog questions stadig i forhold til den nøjagtige mekanisme af ultralyd-induceret cellelysis 18. Vi har vist en sammenhæng mellem fluidiserende cytoskelettet og øget sonic sensitiviteten med ultralyd 15, et fænomen påvist af andre laboratorier 20, lav 21. Derudover har vi fundet, at Microfilament forstyrrelser, såsom cytochalasin B potensere ultralyd følsomhed i flere leukæmi linjer, men ikke hHSC'er eller leukocytter 22, hvilket indikerer, at inhibering af actin-polymerisation kan være en sonosensitizing mekanisme af særlig interesse. Vi har også observeret, at vincristin, en mikrotubulus-forstyrrende middel, der inhiberer tubulin polymerisering 23, 24, øger markant den ultrasoniske følsomhed forskellige leukæmi typer in vitro herunder akut myeloid leukæmi, kronisk myeloid leukæmi og akut lymfoid leukæmi. Derimod cytoskeletale-rettet midler, som stabiliserer cytoskeletale komponenter (paclitaxel end jasplakinolid) ser ud til at gøre celler resistente over for lydbehandling, afspejles i lavere cellelysis 22. Samlet set viser disse data understøtter den hypotese, at fluidisering af cytoskeletale komponenter af neoplastiske celler er faktisk en vigtig faktor i at øge effektiviteten af SDT 25. Den foreliggende undersøgelse viser også, at cholesterol udtømning kan være en anden metode til at yderligere forstærke den ultrasoniske følsomhed af neoplastiske celler, som MeβCD-behandlede U937-celler markant sensibiliseres til 40 kHz ultralyd.
Mens vores sonikering protokoller har vist markant antineoplastisk aktivitet in vitro, er den nuværende metode begrænset til arbejde i kultur og små hvirveldyr modeller, der er i stand til at passe i hætteglassene, der anvendes til lydbehandling. Vi har vist, at zebrafisk kan sikkert sonikeret under anvendelse pulseret lavfrekvent ultralyd (20 kHz), og at deres tolerance over for kemoterapeutiske midler er kvantitativt sammenlignelig meddoser tolereres af murine modeller 26, hvilket antyder, at tumor-bærende zebrafisk kan anvendes i indledende undersøgelser for at vurdere in vivo antineoplastiske aktivitet af disse protokoller. Alligevel indgivelse kemoterapeutiske midler før sonication af mammale modeller er blevet rapporteret i MHz-området 1, og sådanne protokoller kan sandsynligvis blive udvidet til at optage lavfrekvente ultralyd, samt kolesterol-depletterende og cytoskelet-rettet midler.
Potentielle kliniske anvendelser af denne form for SDT kan involvere ekstrakorporal blod lydbehandling, hvor antineoplastiske midler indgives intravenøst (iv) før blodet fjernes for lydbehandling 25. Denne metode fjerner potentielle hindringer lyd i forbindelse med den menneskelige anatomi, og kan være en effektiv måde at ødelægge leukæmiske blaster, samt metastaser fra solide tumorer. Det er også muligt at cholesterol-depletterende og cytoskelet-rettet midler kunneanvendes i HIFU-protokoller, der allerede er til behandling i klinikken i et forsøg på at forbedre effektiviteten af denne behandling modalitet.
De er beskrevet i den foreliggende undersøgelse metoder er i stand til at vurdere værdien af potentielle sonosensitizers, og yderligere system finjustering kan forbedre dette værktøj. Men der er mange variabler, der skal overvejes, når der benyttes ultrasoniske anordninger, herunder strømforsyning kvalitet, akustisk foci, og individuel variation blandt omformere. Derfor vil den fremtidige forskning fokusere på at visualisere lydbølger og forstå deres indflydelse på resultater. SDT har vist at forøge celle lysis in vitro og kan vise sig at være klinisk levedygtigt hvis mere in vivo data i mammale modeller erhverves. Forsøg undersøger andre potentielt udnyttelige egenskaber ved maligne celler, såvel som forskellige kombinerede modaliteter involverer flere midler og ultralyd fortsætte i vores laboratorium.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank the staff of the Syracuse University Department of Physics workshop for their innovative assistance in matters relating to our system design.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium w/ NaHCO3 & 25mM Hepes | Life Technologies | 12440079 | |
Amphotericin B Solution | Sigma-Aldrich | A2942 | |
Penicillin/Streptomycin 100x Solution | Life Technologies | 10378-016 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12105 | |
Branson SLPe 40kHz Cell Disruptor with 3" (25mm) Cuphorn | Branson Ultrasonics | 101-063-726 | sonication device |
Brisk Heat SDC Benchtop Digital temperature Controler w/ 1000mL Beaker Heater | Brisk Heat | SDCJF1A-GBH1000-1 | heater used for temperature control |
Beckman-Coulter Z2 Cell Sizer with AccuComp® Software | Beckman-Coulter | 6605700 | |
Bio-Rad TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 145-0102 | |
Gentamicin 50mg/mL | Sigma-Aldrich | G1397 | |
Trypan Blue Solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
Falcon 50mL & 25mL Vented Culture Flasks | Fisher Scientific | 353082 | |
Lonza L-Glutamine 200mM 0.85% NaCl | Lonza | 17-605C | |
Seal-Rite 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1615-5510 | |
Beckman-Coulter Accuvette ST 25mL Vials and caps | Beckman-Coulter | A35473 | |
AccuJet Pro Auto Pipet | BrandTech Scientific | 26330 | |
USA Scientific 10mL Disposable Serological Pipets | USA Scientific | 1071-0810 | |
Tip One 100uL and 1000uL Filter Tips | USA Scientific | 1120-1840, 1126-7810 | |
100uL Micropipette | Wheaton | 851164 | |
1000uL Micropipette | Wheaton | 851168 | |
BioRad Dual Chamber Counting Slides | Bio-Rad | 145-0015 | |
Forma Scientific Dual chamber water jacketed Incubator | Forma Scientific | 3131 | |
Tektronix DPO 2002B Digital Phosphor Oscilloscope | Tektronix | DPO2002B | used to measure the ultrasonic waveform |
PPB MegaSonics Model PB-500 Ultrasonic Energy Meter | PPB Megasonics | PB-500 | used to assess the sound intensity in W/cm2 |
Teledyne RESON TC4013-1 Hydrophone | Teledyne | TC4013-1 | connects to the oscilloscope |
Wheaton 250mL Flasks | Sigma-Aldrich | Z364827 | |
20mL Glass Scintillation Vials | Sigma-Aldrich | Z190527 | |
Beckman-Coulter Isotonic Saline Solution | Beckman-Coulter | N/A | diluent for Z2 counter |
Chloroform 99% | Sigma-Aldrich | C2432 | |
Ethanol 200 Proof Anhydrous | Sigma-Aldrich | 459836 | |
Mineral Oil | N/A | ||
XTT Cell Proliferation Assay Kit | ATCC | 30-1011K | |
96-Well Microplate Reader | Cole-Palmer | EW-13055-54 | |
U937 Human Monocytic Leukemia Cells | ATCC | CRL1593.2 | |
THP1 Human Monocytic Leukemia Cells | ATCC | TIB-202 |