Selective damage of human leukemia cells can be achieved through a novel approach of applying low frequency ultrasound both with and without chemotherapeutic pretreatment of leukemic and normal hematopoietic cells.
Low frequency ultrasound in the 20 to 60 kHz range is a novel physical modality by which to induce selective cell lysis and death in neoplastic cells. In addition, this method can be used in combination with specialized agents known as sonosensitizers to increase the extent of preferential damage exerted by ultrasound against neoplastic cells, an approach referred to as sonodynamic therapy (SDT). The methodology for generating and applying low frequency ultrasound in a preclinical in vitro setting is presented to demonstrate that reproducible cell destruction can be attained in order to examine and compare the effects of sonication on neoplastic and normal cells. This offers a means by which to reliably sonicate neoplastic cells at a level of consistency required for preclinical therapeutic assessment. In addition, the effects of cholesterol-depleting and cytoskeletal-directed agents on potentiating ultrasonic sensitivity in neoplastic cells are discussed in order to elaborate on mechanisms of action conducive to sonochemotherapeutic approaches.
الموجات فوق الصوتية يشير إلى أي موجة ضغط الصوت تتأرجح مع تردد أكبر من الحد الأعلى من القدرات السمعية الإنسان (~ 20 كيلو هرتز) 1. وقد استخدمت الموجات فوق الصوتية المنخفضة التردد في نطاق 20-60 كيلو هرتز في المختبر كوسيلة لتوليد المستحلبات، وإعداد العينات الخلوية لاستخراج الحمض النووي، لتعطيل الأنسجة، ومجموعة متنوعة من الاختبارات الأخرى. كما تم تمديد فائدة منخفضة التردد الموجات فوق الصوتية إلى الإعداد الصناعي لحام، مواد التنظيف المختلفة، وتجهيز المواد. تجاريا مولدات الموجات فوق الصوتية المتاحة تأتي في ترددات تتراوح 18-60 كيلو هرتز، وعلى نطاق واسع wattages من 100-1،200 W.
على الرغم من أن الموجات فوق الصوتية طالما استخدمت في إعداد سريرية للتصوير التشخيصي، وقد تم تطبيقه كطريقة علاجية إلا في الآونة الأخيرة. الموجات فوق الصوتية ≥1 ميغاهيرتز قادر على تعطيل بأمان الحصيات البولية (حصى الكلى) وحصيات صفراوية (الحجارة في الالبريد المرارة أو في الكبد) في المرضى الذين للحد من أعراض 2،3. الآن تطبيق هذا النهج المعروف خارج الجسم وحدثت الهزة الارضية تفتيت الحصوات (ESWL) على نطاق واسع في العيادة (يتم التعامل مع أكثر من مليون مريض سنويا مع ESWL في الولايات المتحدة وحدها 4)، ويقدم طريقة يمكن من خلالها غير جراحية تفريق حسابات التفاضل والتكامل مع الحد الأدنى من الأضرار الجانبية من خلال استخدام تطبيقها خارجيا، وركزت، كثافة عالية النبضات الصوتية 2-4.
نظرا لقوات فريدة من نوعها مباشرة القص، وكذلك فقاعات التجويف الناتجة عن ارتفاع كثافة الموجات فوق الصوتية، وقد تم فحص هذه المنهجيات في علاج السرطان لعلاج مقاومة للسرطان البروستاتا والخصي غدية البنكرياس في نهج المعروفة باسم الموجات فوق الصوتية عالية الكثافة مركزة (HIFU ) 5-8. بطريقة مشابهة جدا لESWL، يستخدم HIFU أشعة الموجات فوق الصوتية المتعددة ويركز عليها في مجال التركيز المحدد إلى توليد درجات الحرارة من 60 درجة مئوية أو المهزومةلها من خلال استخدام الطاقة الصوتية، الأمر الذي أدى نخر التجلط في الأنسجة المستهدفة 5. على الرغم من أن طرائق أخرى الاجتثاث الحرارية موجودة حاليا (الاجتثاث الترددات الراديوية والاجتثاث الميكروويف)، HIFU يوفر ميزة واضحة على هذه الطرق من حيث أنه هو طريقة حموي غير الغازية الوحيدة 5. HIFU حققت نتائج متباينة في العيادة وهي الوحيدة المتاحة حاليا في التجارب السريرية 11/08. ومع ذلك، فإن النجاح المحدود الذي حققته، واعدة جدا في البيانات الجسم الحي تم الحصول عليها من نماذج الثدييات قبل السريرية أثبتت إمكانية الموجات فوق الصوتية في علاج السرطان.
في محاولة لتحسين HIFU، وقد حاول الباحثون في الجمع بين الموجات فوق الصوتية مع مضادات الأورام المناسب لإنشاء نموذج من sonochemotherapy. العلاج Sonodynamic (المعاملة الخاصة والتفضيلية) هو طريقة العلاج الجديدة الواعدة التي أثبتت النشاط الأورام مثير للإعجاب في كل من في المختبر، و <em> في الدراسات المجراة 1. وقد تبين أن الموجات فوق الصوتية بشكل تفضيلي يدمر الخلايا الخبيثة على أساس الفرق بين حجم هذه الخلايا وتلك الأنسجة العادية 1،5. المعاملة الخاصة والتفضيلية تضم وكلاء المتخصصة المعروفة باسم sonosensitizers لزيادة مدى الضرر تفضيلية بواسطة الموجات فوق الصوتية تمارس ضد الخلايا الورمية. بينما التطبيقات العلاجية المعاملة الخاصة والتفضيلية درست سابقا، وأنظمة الموجات فوق الصوتية التي تستخدم عادة تستخدم الموجات فوق الصوتية العالي التردد (≥1 ميغاهيرتز)، والآثار المترتبة على انخفاض كيلوهرتز تردد الموجات فوق الصوتية لم يتم بعد استكشافها بشكل كامل. ترددات أقل من الموجات فوق الصوتية غالبا ما تكون أكثر كفاءة في إنتاج التجويف بالقصور الذاتي، وهي الظاهرة التي تؤدي إلى تدمير الخلايا بسبب المنهارة السريع لmicrobubbles، الأمر الذي أدى الأضرار الفيزيائية 12-14. ويعزى هذا الاختلاف في توليد التجويف بالقصور الذاتي بين ميغاهيرتز وانخفاض كيلو هرتز الموجات فوق الصوتية إلى حقيقة أن انخفاض ترددات موجة تمكن microbubbleق مزيد من الوقت لينمو بنسبة انتشار تصحيحه في دورة نصف التوسع، وبالتالي إنتاج انهيار أكثر عنفا خلال النصف دورة ضغط التالية 12.
لقد أظهرنا سابقا أن U937 خلايا سرطان الدم الوحيدات الإنسان حساسة لانخفاض الموجات فوق الصوتية تردد (23.5 كيلو هرتز)، وأن هذه الحساسية ويمكن زيادة بشكل ملحوظ من خلال تطبيق مضادات الأورام التي التشويش على الهيكل الخلوي 15. وعلاوة على ذلك، لقد أثبتنا أن الخلايا التالفة تفضيلي على أساس الحجم، مع الخلايا الكبيرة واظهار حساسية أعلى بالموجات فوق الصوتية. بالإضافة إلى ذلك، الخلايا الطبيعية البشرية المكونة للدم الجذعية (hHSCs) والكريات البيض في أحجام خلية قابلة للمقارنة هي أكثر مقاومة للصوتنة من نظرائهم الورمية 15، مما يشير مبدئيا أن المنخفض الموجات فوق الصوتية تردد يمكن أن تستخدم لتدمير الخلايا الخبيثة بشكل تفضيلي في وجود الأنسجة الطبيعية.
لمواصلة دراسة دعامة فريدة من نوعهاerties المنخفض الموجات فوق الصوتية تردد للاستخدام العلاجي محتمل، وقد طورنا إجراءات التنظيف والاستقرار لزيادة الفعالية والموثوقية واحد من أنظمة صوتنة الحالية لدينا، وبرانسون نموذج SLPe 150 W، 40 كيلو هرتز ديسروبتر الخلية، مجهزة 20 ملم القرن تركيبها الى 7.62 سم الكأس. بالإضافة إلى ذلك، كنا قادرين على تحديد دقيق الطاقات عينة التجويف، وكذلك الطول الموجي متسقة والسعة ضمن نطاق 40 كيلو هرتز باستخدام متر التجويف والذبذبات مع مائي. بواسطة التكرير وتنظيم بروتوكولات لدينا، وكنا قادرين على تحقيق الاتساق في sonications التجريبية لدينا، مما يسمح لنا مقارنة كميا الحساسيات الصوتية الخلايا الورمية وطبيعية الأنساب مكون للأنسجة المختلفة. وتقدم لدينا بروتوكول لنظام 40 كيلو هرتز في التفاصيل واسعة من أجل المختبرات المهتمة لتكون قادرة على إجراء التجارب المقارنة، وتقييم النتائج التي توصلنا إليها من الآثار التي تسببها موانع الأوراممنخفض فوق الصوتية تردد. بالإضافة إلى ذلك، ندرس الجرعة الآثار تعتمد من ميثيل β-سيكلودكسترين (MeβCD؛ الشكل 1)، وكيل المستنفدة الكوليسترول في الدم، على زيادة حساسية بالموجات فوق الصوتية من U937 وTHP1 خلايا سرطان الدم الوحيدات الإنسان.
لتحقيق أفضل النتائج، ينبغي إيلاء عناية خاصة لوضع بعناية العينة وتنظيف اتحاد المحول قرن. وضع العينة في القرن مهم للحصول على تدمير الخلايا ثابت، وتغيير المسافة من القرن سوف يغير البؤر الصوتية، وبالتالي تغيير الطاقة تتعرض العينة ل. الطاقة الصوتية في القرن كوب يمكن تعيين باستخدام متر التجويف للعثور على موقف الأقصى التجويف. وبالإضافة إلى ذلك، فإن التجويف متر، جنبا إلى جنب مع الذبذبات حيوية لتحديد شدة الصوت وتتعرض الخلايا ل، وكذلك تجانس الموجي. ولذلك، ينبغي أن تستخدم هذه الأدوات للكشف عن المشاكل مع النظام، وتساعد على تحديد ما قد تكون هناك حاجة إلى استكشاف الأخطاء وإصلاحها لتصحيح عدم استقرار النظام.
كما ذكر سابقا، فإن نظام التردد المنخفض قد تعمل على مزيد من ديغا المياه في كافة مراحل التجربة إذا لم يرشح نفسه لقبل عدة دقائق لأخذ عينات صوتنة. يجب أن يتم تنفيذ هذا المدى الأولي أن تسفر عن نتائج بالتالي تتفق المتوسطة صوتنة نزع الغاز نسبيا وخلال التجارب. بالإضافة إلى ذلك، لا ينبغي أن sonicated الخلايا في أو بالقرب من الحد الأقصى لسعة عند تقييم فعالية sonosensitizers، حيث أن الحجم الحقيقي للتوعية سيكون من الصعب تقييم. باستخدام 33٪ السعة على النظام كيلو هرتز 40 هو المكان المثالي، كما أنها تنتج ضرر ملحوظ، ولكنها توفر sonosensitizers مجالا واسعا لإثبات فعاليتها، كما هو موضح مع MeβCD ضد U937 والخلايا THP1 (الشكل 7). تؤكد هذه البيانات أيضا أن MeβCD محسس خطوط اللوكيميا متعددة لمنخفض فوق الصوتية تردد بطريقة تعتمد على الجرعة.
كان هناك عدد من التجارب القيام به مع ارتفاع وتيرة في حدود 0.75 ميغاهيرتز إلى 8 ميغاهيرتز تظهر أدلة على فقاعات التجويف intramembrane التي يتم توليدها من خلال صوتنة 17-19. ومع ذلك، سؤال فيNS لا تزال في ما يخص الآلية الدقيقة التي يسببها الموجات فوق الصوتية المحمولة تحلل 18. لقد أظهرنا وجود صلة بين fluidizing الهيكل الخلوي وزيادة الحساسية الصوتية باستخدام الموجات فوق الصوتية ذات التردد المنخفض 15، وهي ظاهرة أبداه غيرها من المختبرات 20، 21. وبالإضافة إلى ذلك، فقد وجدنا أن عوامل تعطيل خييط مثل مثبط حركة الخلايا B تحفيز حساسية بالموجات فوق الصوتية في اللوكيميا متعددة خطوط، ولكن ليس hHSCs أو الكريات البيض 22، مما يدل على أن تثبيط الأكتين البلمرة قد تكون آلية sonosensitizing ذات أهمية خاصة. وقد لاحظنا أيضا أن فينكريستين، وكيل المخل أنيبيب الذي يمنع تويولين البلمرة 23، 24، ويزيد بشكل ملحوظ حساسية بالموجات فوق الصوتية من أنواع سرطان الدم في المختبر المختلفة بما في ذلك سرطان الدم النخاعي الحاد وسرطان الدم النخاعي المزمن، وسرطان الدم الليمفاوي الحاد. على النقيض من ذلك، وكلاء الموجه هيكل الخلية التي استقرار مكونات هيكل الخلية (باكليتاكسيل لد jasplakinolide) تظهر لجعل خلايا مقاومة للصوتنة، التي تعكسها معدلات أقل من خلية تحلل 22. أخذت معا، وهذه البيانات تدعم الفرضية القائلة بأن fluidizing مكونات هيكل الخلية من الخلايا الورمية هي في الواقع عاملا مهما في زيادة فعالية المعاملة الخاصة والتفضيلية 25. يوضح هذه الدراسة أيضا أن نضوب الكولسترول قد تكون طريقة أخرى يمكن من خلالها زيادة تحفيز حساسية الخلايا الورمية بالموجات فوق الصوتية، وتوعية الخلايا U937 MeβCD معاملتهم بشكل ملحوظ إلى 40 كيلو هرتز الموجات فوق الصوتية.
بينما البروتوكولات صوتنة لدينا وقد أثبتت النشاط الأورام ملحوظ في المختبر، والمنهجية الحالية تقتصر على العمل في مجال الثقافة والفقاريات الصغيرة النماذج التي هي قادرة على احتواء في قارورة تستخدم لصوتنة. لقد أظهرنا أنه الزرد يمكن sonicated بأمان باستخدام نابض الموجات فوق الصوتية ذات التردد المنخفض (20 كيلو هرتز)، والتي تحملهم إلى وكلاء العلاج الكيميائي للمقارنة كميا لجرعة التسامح التي كتبها نماذج الفئران 26، مما يوحي بأن الزرد الورم الحاملة يمكن أن تستخدم في التحقيقات الأولية لتقييم النشاط في الجسم الحي الأورام من هذه البروتوكولات. ومع ذلك، وإدارة وكلاء العلاج الكيميائي قبل صوتنة نماذج الثدييات تم الإبلاغ في نطاق ميغاهيرتز 1، ويمكن على الأرجح هذه البروتوكولات أن تمتد إلى دمج منخفض فوق الصوتية تردد، وكذلك الكوليسترول للأوزون وكلاء الموجه هيكل الخلية.
التطبيقات السريرية المحتملة لهذا النوع من المعاملة الخاصة والتفضيلية قد تنطوي صوتنة الدم خارج الجسم والتي تدار مضادات الأورام عن طريق الوريد (IV) قبل الدم يتم إزالتها لصوتنة 25. يزيل هذا الأسلوب حواجز الصوت التي يمكن أن تمثلها تشريح جسم الإنسان، ويمكن أن يكون وسيلة فعالة لتدمير التفجيرات اللوكيميا، وكذلك الانبثاث من الأورام الصلبة. ومن الممكن أيضا أن الكولسترول للأوزون وكلاء الموجه هيكل الخلية يمكناستخدامها في بروتوكولات HIFU التي هي بالفعل يجري بحثها في العيادة في محاولة لتحسين فعالية هذا النمط من المعالجة.
الطرق الموضحة في هذه الدراسة هي القادرة على تقدير قيمة sonosensitizers المحتملة، وإلى مزيد من الصقل النظام قد تعزيز هذه الأداة. ومع ذلك، هناك العديد من المتغيرات التي سيتم أخذها في الاعتبار عند استخدام هذه تستنبط بالموجات فوق الصوتية، بما في ذلك الطاقة جودة العرض، بؤر الصوتية، وجود فروق فردية بين المحولات. لذلك، سوف تركز البحوث المستقبلية على الرؤية والموجات الصوتية وفهم تأثيرها على النتائج. وقد أظهرت المعاملة الخاصة والتفضيلية لتعزيز تحلل الخلايا في المختبر، وقد تكون قابلة للحياة سريريا إذا كان أكثر في البيانات الجسم الحي في نماذج الثدييات يتم الحصول عليها. ولا تزال التجارب دراسة الخصائص الأخرى تجعلهم عرضة للاستغلال من الخلايا الخبيثة، فضلا عن مختلف طرائق مشتركة تنطوي على عوامل متعددة والموجات فوق الصوتية في مختبرنا.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank the staff of the Syracuse University Department of Physics workshop for their innovative assistance in matters relating to our system design.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium w/ NaHCO3 & 25mM Hepes | Life Technologies | 12440079 | |
Amphotericin B Solution | Sigma-Aldrich | A2942 | |
Penicillin/Streptomycin 100x Solution | Life Technologies | 10378-016 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12105 | |
Branson SLPe 40kHz Cell Disruptor with 3" (25mm) Cuphorn | Branson Ultrasonics | 101-063-726 | sonication device |
Brisk Heat SDC Benchtop Digital temperature Controler w/ 1000mL Beaker Heater | Brisk Heat | SDCJF1A-GBH1000-1 | heater used for temperature control |
Beckman-Coulter Z2 Cell Sizer with AccuComp® Software | Beckman-Coulter | 6605700 | |
Bio-Rad TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 145-0102 | |
Gentamicin 50mg/mL | Sigma-Aldrich | G1397 | |
Trypan Blue Solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
Falcon 50mL & 25mL Vented Culture Flasks | Fisher Scientific | 353082 | |
Lonza L-Glutamine 200mM 0.85% NaCl | Lonza | 17-605C | |
Seal-Rite 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1615-5510 | |
Beckman-Coulter Accuvette ST 25mL Vials and caps | Beckman-Coulter | A35473 | |
AccuJet Pro Auto Pipet | BrandTech Scientific | 26330 | |
USA Scientific 10mL Disposable Serological Pipets | USA Scientific | 1071-0810 | |
Tip One 100uL and 1000uL Filter Tips | USA Scientific | 1120-1840, 1126-7810 | |
100uL Micropipette | Wheaton | 851164 | |
1000uL Micropipette | Wheaton | 851168 | |
BioRad Dual Chamber Counting Slides | Bio-Rad | 145-0015 | |
Forma Scientific Dual chamber water jacketed Incubator | Forma Scientific | 3131 | |
Tektronix DPO 2002B Digital Phosphor Oscilloscope | Tektronix | DPO2002B | used to measure the ultrasonic waveform |
PPB MegaSonics Model PB-500 Ultrasonic Energy Meter | PPB Megasonics | PB-500 | used to assess the sound intensity in W/cm2 |
Teledyne RESON TC4013-1 Hydrophone | Teledyne | TC4013-1 | connects to the oscilloscope |
Wheaton 250mL Flasks | Sigma-Aldrich | Z364827 | |
20mL Glass Scintillation Vials | Sigma-Aldrich | Z190527 | |
Beckman-Coulter Isotonic Saline Solution | Beckman-Coulter | N/A | diluent for Z2 counter |
Chloroform 99% | Sigma-Aldrich | C2432 | |
Ethanol 200 Proof Anhydrous | Sigma-Aldrich | 459836 | |
Mineral Oil | N/A | ||
XTT Cell Proliferation Assay Kit | ATCC | 30-1011K | |
96-Well Microplate Reader | Cole-Palmer | EW-13055-54 | |
U937 Human Monocytic Leukemia Cells | ATCC | CRL1593.2 | |
THP1 Human Monocytic Leukemia Cells | ATCC | TIB-202 |