Summary

Öğrenmenin Ayrık Aşama sırasında Kemirgenler uzaktan suskunluğu Sinir Aktivitesi Bir Yöntem

Published: June 22, 2015
doi:

Summary

This protocol describes how to temporarily and remotely silence neuronal activity in discrete brain regions while rats are engaged in learning and memory tasks. The approach combines pharmacogenetics (Designer-Receptors-Exclusively-Activated-by-Designer-Drugs) with a behavioral paradigm (sensory preconditioning) that is designed to distinguish between different components of learning.

Abstract

Bu protokol hayvanların öğrenme ve bellek işlerle meşgul iken geçici ve uzaktan ayrık beyin bölgelerinde nöronal aktivitenin susturmak açıklamaktadır. yaklaşım birleştiren farmakogenetik (Tasarımcı-Reseptörler-Münhasıran-Aktif-by-Designer-İlaçlar) bir davranış paradigma (duyusal önkoşullama) ile öğrenmenin farklı biçimlerde ayırt üzere tasarlanmıştır. Spesifik olarak, viral kaynaklı dağıtım, bir genetik olarak tadil edilmiş inhibe edici G-protein bağlı reseptör kemirgen içinde ayrı bir beyin bölgesine (tasarımcı Reseptör) ifade etmek için kullanılır. Tasarımcı reseptör ekspresyon düzeyleri yüksek olduğunda Üç hafta sonra, bir farmakolojik ajan (Tasarımcı İlaç) önce belirli bir davranış oturuma sistemik 30 dakika uygulanır. ilaç tasarım reseptörü için afiniteye sahiptir ve bu nedenle tasarım reseptörünü eksprese eden nöronların inhibisyonu ile sonuçlanır, ancak aksi takdirde, biyolojik olarak inerttir. beyin bölgesi (2-5 saat susturulmuş vin kalırding) doz ve uygulama yoluna. Davranışsal paradigmanın tamamlayan beyin dokusu doğru yerleştirme ve reseptör ifadesi için değerlendirilir. Bu yaklaşım, davranış belirli bileşenleri tek tek beyin bölgelerinin katkı belirlenmesi ve davranışsal paradigmaların bir dizi boyunca kullanılabilir için özellikle yararlıdır.

Introduction

Davranışsal nörobilim alanında heyecan verici bir meydan okuma, karmaşık davranışlar nöral substratlar belirlemektir. Böyle kalıcı lezyonlar, kanüller implantlar yoluyla geçici beyin inaktivasyonu ve optogenetics olarak bir dizi teknik, karmaşık davranışlar alt bileşenleri ayrık beyin bölgelerinin katkıları belirlemek için kullanılmıştır. Bu yaklaşımlar öğrenme sırasında bölgesel özgüllük anlayışımızı haberdar ederken, her teknik sınırlamaları olmadan değildir. Özellikle kalıcı lezyonlar genellikle böylece etkileri paradigma süresince mevcut, davranış testi öncesinde yapılmaktadır. Beyin dokusunda önemli bir hasar üretebilir kısa süreli sinir inaktivatör (örneğin, tetrodotoxin) sunumunu içeren ve hemen önce davranışsal test konularda strese neden olabilir kanülasyon çalışmaları. Bundan başka, kanülasyon yoluyla etkisiz hale getirilmesi çevreleyen doku bölgesi ile sınırlıdırkanül ucu. Optogenetics spesifik beyin bölgelerinde aktivitesi zamansal kontrolü için bir esneklik sunar ise Son olarak, bu maliyetlidir ve teknik olarak zor olduğu.

Bu sınırlamalar bir farmakogenetik yaklaşım (Tasarımcı-Reseptörler-Münhasıran-Aktif-by-Designer-İlaçlar, DREADDs) 1,2 kullanılarak aşılabilir. Farmakogenetik kavramı gelişmiş iken önemlisi, tekniğin yürütme basittir. Bir tadil edilmiş inhibitör G-proteine ​​akuple bir reseptör için bir DNA fragmanını içeren bir toksin (örneğin, NMDA, ibotenik asit) ayn beyin bölgeleri içine, bu teknik, bir adeno-bağlantılı virüs (AAV) infüzyonu içerir infüzyonu içeren geleneksel bir stereotaksik cerrahi yöntemlere benzer (hM4Di; tasarımcı reseptörü) standart laboratuar kemirgenler ilgi bölgeye (Şekil 1). viral vektör, bir floresan haberci (mcitrine) içerir. Dahil kezhücrelere, tasarımcı reseptörü (ve raportör protein) maksimum ~ 3 hafta sonra infüzyon ifade edilir ve seçici olarak, aksi biyolojik olarak eylemsiz tasarım ilacın sistemik olarak uygulanması, klozapin-N-oksit ile 2-5 st için aktive edilebilir (CNO) 1 3. Deneyci, belirli beyin bölgelerinde nöral aktivitenin üzerinde kesin, ancak uzaktan kumanda zamansal sahip olduğundan, farmakogenetik birden aşamalarda yürütülen davranışsal paradigmalar ile özellikle de birleştirir. Bu örnekte, retrosplenial korteks katkısı (RSC) uyaran-uyaran öğrenme Pavlov öğrenmedeki rolü ile karşılaştırıldığında, ancak yaklaşımların bu kombinasyon beyin bölgelerinin nasıl katkıda özgü tespit etmeye sorulardan herhangi bir sayı için uygundur Karmaşık davranış.

Bu protokolde tarif edilmemiş ise ek olarak, viral ve transjenik yaklaşımlar hücre tipine spesifik DREADD ifade 2 elde etmek için kullanılabilir. IDREADD yaklaşımı kullanıldığında s doğasında deneysel manipülasyonlar, deneysel tasarım ve sonraki kantitatif analiz dikkatli dikkate farmakolojik ve / veya diğer türde içeren davranışsal paradigmalar gereklidir. DREADD yaklaşım yeni Deneyciler mevcut DREADD teknolojisi 2 kapsamlı bir inceleme adlandırılır.

Her gün, organizmalar yeni uyaranlara ve olayları ve birbirlerine olan ilişkileri hakkında bilgi edinin. Hatta tanıdık bir ortamda, örneğin ev, biri bu değişikliklerin anlamlı olayların tahmin olabilir, çünkü uyaranlara arasındaki ilişkilerde değişiklikler tespit etmek hızlıdır. Böyle bir uyaran-uyaran (örneğin, ilişkisel) öğrenme birden uyaranların conjoining içerir ve geleneksel medial temporal lobda 4 içinde merkezi bulunduğu hipokampus ile ilişkili olmuştur. Ancak, hipokampus var, ne de tek başına hareket etmez; içinde ve dışında hem kortikal bölgelermedial temporal lob yan hipokampal formasyon 5-7 kritik duyusal bilgi sağlar. Geleneksel kalıcı lezyon çalışmaları hipokampus bağımlı öğrenme kortikal bölgelere (örneğin, retrosplenial postrhinal ve entorinal korteks) bir dizi katılımı için ikna edici bir kanıt sağlar, ancak ayrı aşamalarında belirli bir bölgede rolünü ayırt etme yeteneği sınırlıdır 8-10 öğrenme.

Mevcut protokol RSC 3 fazlı duyusal önkoşullamasının paradigma 11,12 tek bir aşamasında RSC susturma yoluyla uyaran-uyaran öğrenme için gerekli olan hipotezini test eder. Kısaca, sıçanlar tasarım reseptörü içerir ve ~ 3 hafta sonra davranış testleri başlamadan önce tasarım madde (CNO) 30 dakika süresince verilir bir AAV infüzyonu yapılan. Mevcut protokolde, deneysel fareler test ilk aşamasında (uyarıcı-uyarıcı lear sırasında CNO alıyorsunuzning oluşur) ve test sonraki 2 aşamalarında aracı alırsınız. Davranışına CNO yanlışlıkla etkilerini kontrol etmek için, tasarım reseptörü (hM4Di) farelere süzülür ve bunun yerine CNO bir araç ile enjekte edilir. Viral infüzyon ve reseptör ifadesinin genel etkileri hesaba katmak için, tasarımcı reseptörü içeren ve CNO yönetmek değil bir kontrol virüsü demlenmeye.

AAV, farklı serotiplerin çok sayıda genetik bir malzeme uygulamak üzere kullanılır. rekombinant veya sentetik moleküllerini içeren Araştırma mevcut NIH Kılavuzu transgen potansiyel tümörijenik gen ürünü ya da bir toksin molekülü ya da kodlamak etmez ve yokluğunda üretildiği bu AAV (bütün serotipler) ve rekombinant ya da sentetik AAV yapıları korur Yardımcı virüs, BSL-1 önlemler (Ek B-1. Risk Grubu 1 (RG1) Acenteleri) 13 gerektirir. AAV yapısı, programı ve güvenlik ile ilgili yorumunun sayısı 14,15 mevcuttur. Özellikle, olsaAAV ile çalışırken, kemirgenlerde muhtemel üreme 16,17 ve potansiyel kanserojen mekanizmalar 18-20 ilişkin endişeler nedeniyle, bazı kurumlar BSL-2 önlemlerin kullanılmasını gerektirir. Araştırma Hastalık Kontrol ve ABD'de gen manipülasyonu için viral vektörler kullanılırken Rekombinant DNA Moleküller 13 İçeren Araştırma NIH Rehberi için, Merkezleri yapılacaktır bireysel kurumlarında gözetim komiteleri ile danışarak kullanımdan önce uygun BSL doğrulayın. Kişisel korunma, araştırmacı eğitimi, vektör çevreleme, dekontaminasyon, dekontamine malzemelerin imhası ve enjeksiyon sonrası hayvan barınağı gereksinimleri bu yönergelere göre belirlenir. Buna ek olarak, danışmak ve uygun Kurumsal Hayvan Bakım izleyin ve güvenli kullanım, yönetim ve AAV'nin bertarafını sağlamak için komite kurallarına veya eşdeğer kurumsal gözetim komitesi yönergeleri kullanın.

Protocol

hayvanların kullanımı Oberlin College Kurumsal Hayvan Bakım tarafından onaylanmış ve komite kullanın ve Laboratuvar Hayvanları 21 Bakım Kılavuzu ile uyumlu ve Kullanımı vardır. Viral İnfüzyon 1. Hazırlık Not: Bu protokol BSL-1 önlemleri kullanır. BSL-2 önlemleri, tek kullanımlık laboratuvar önlüğü, eldiven, ayakkabı kapakları, göz korumaları ve maske (N95 tipi) kullanıldığında gereklidir. BSL-2 bileşikleri işleme Tüm…

Representative Results

Davranış Sonuçlar Deneyin tamamlanması üzerine, bölgeye özgü geçici inaktive etkinliği nicel ve nitel olarak değerlendirilmelidir. Mevcut örnek CNO RSC nötr uyarıcılara 12 arasında dernek oluşumu için gerekli olan hipotezini test etmek Preconditioning oturumları sırasında RSC nöral aktiviteyi azaltmak için uygulanan edildiği bir 3 fazlı davranışsal paradigma (duyusal önşartlama), içerir. Önemli olarak, deneyi davranış paradigma ya farmakogenetik yakla…

Discussion

Bu protokol, belirli bir beyin bölgesi çok fazlı karmaşık öğrenme görevi nasıl katkıda araştırmak için bir farmakogenetik yaklaşım (DREADD) uygulamak açıklamaktadır. Geçici ve uzaktan öğrenme aşamalarında farklı beyin bölgelerinde nöral aktiviteyi susturmak için yeteneği ile, yaklaşımların bu kombinasyon öğrenmenin daha nüanslı ve maskeli formları dahil olmak üzere davranışları geniş bir yelpazede, araştırmak için bir platform sağlar. Bu protokol açıklanan örnekte, retrosp…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz bu protokol kısmen türediği yazının katkılarından dolayı Robinson ve ark., 12 yazarları teşekkür ederim.

Materials

Male, Long Evans Rats, 55-60 d Hilltop Lab Animals Inc
rAAV8/hSyn-HA-hM4D(Gi)-IRES-mCitrine Virus Vector Core Caution:  This is a BSL-1 compound
rAAV8/hSyn-GFP Virus Vector Core Caution:  This is a BSL-1 compound
Clozapine-N-Oxide R&D Systems 4936-10 Designer Drug
Rat Cage lid (Polycarbonate) Alternative Design  FT 8XL-PC Used to cover animal cages 48-72 hours post infusion
Filer Paper (Replacement) Alternative Design  FP-R-1018XAD Filter paper that goes with cage lids
Table Top Vise JETS 2201-265 For holding microscentrifuge tubes containing AAV in the hood
Medline Biohazard liners  Staples 113444 Biohazard Trash Bags
United Solutions 34 gallon rectangular wheeled trashcan with hook and lock handle  Amazon.com Biohazard Trash Can
Isoflurane, 100 mL Patterson Veterinary Supply Inc.  07-890-8540 Anesthetic
Dual Small Animal Stereotaxic with Digital Display Readout Console David Kopf Model 942 Surgical equipment
Non-rupture Ear Bars, set of 2 (Rat) David Kopf Model 955 Surgical equipment
Anesthesia Mask (Rat) David Kopf Model 906 Surgical equipment
High speed Stereotaxic drill includes table top motor controller, foot pedal, handpiece, stereotaxic handpiece holder David Kopf Model 1474 Surgical equipment
Microdrill burrs, 0.9 mm Fine Science Tools Inc 19007-09 Surgical supply
Automated Syringe pump with Micro4 Controller  David Kopf Model UMP3-1 Surgical equipment
Pro-animal detachable Ceramic Blade Clipper Kit Ahdis 21420 Surgical supply
Betadine Skin Cleanser Perdue  Products L.P 67618-149-04 Surgical supply
Triple Antiobiotic Ointment Medline Supply 53329-087-01 Surgical supply
Puralube Vet Ointment Only Veterinary Supply 17033-211-38 Surgical supply
Dino-lite  Microscope AD7013MTL An alternative to the traditional disection scope
Dino-lite Rigid TableTop Boom Stand Microscope MS36B Surgical equipment
28 Gauge 10uL Syringe Hamilton  80308-701SN Surgical equipment
Extra Tall MDF Sound attenuating Cubicle Med Associates, Inc ENV-018MD 22'Wx22"Hx16"D
Extra Tall Modular Test Chamber Med Associates, Inc ENV-007 Behavioral equipment
Stainless Steel Grid Floor  Med Associates, Inc ENV-005 Behavioral equipment
House Light Med Associates, Inc ENV-215M Used as the house light and stimulus light
Modular Pellet Dispenser  Med Associates, Inc ENV-203M-45 Behavioral equipment
Pellet Recetacle, Cup Type Med Associates, Inc ENV-200R1M Behavioral equipment
Head Entry Detector for Rat Med Associates, Inc ENV-254-CB Behavioral equipment
Dustless precision food pellets, 45 mg Bio-Serv F0165 Behavioral supply
Cage Speaker for Rat Chamber Med Associates, Inc ENV-224AM Behavioral equipment
Programmable Audio Generator  Med Associates, Inc ANL-926 Behavioral equipment
Smart Ctrl 8 Input/16 output Package Med Associates, Inc DIG-716P2 Behavioral equipment
Large Table Top Cabinet and Power Supply Med Associates, Inc SG-6510D Behavioral equipment
PCI Interface Package Med Associates, Inc DIG-700P2-R2 Behavioral equipment
MED Intel core Computer Pkg with X Pro 19" Monitor Med Associates, Inc COM-103V Behavioral equipment
Paraformaldehyde (grannular), 1 kg Electron Microsopy Sciences 19210 Hazard:  carcinogen, weigh in hood
Rabbit Monoclonal antibody (HA-Tag) Cell Signaling Technologies  3724S Histology reagent
XP Rabbit monoclonal antibody (GFP) Cell Signaling Technologies  2956S Histology reagent
Anti-Rabbit IgG Cell Signaling Technologies  4412S Histology supplies
Superfrost Plus slides  VWR international 483111-703 Histology supplies

References

  1. Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G-protein coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (12), 5163-5168 (2007).
  2. Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs): Chemogenetic tools with therapeutic utility. Annu. Rev. Pharmacol.Toxicol. 55, 399-417 (2015).
  3. Weiner, D. M. The role of M1 muscarinic receptor agonism of N-desmethylclozapine in the unique clinical effects of clozapine. Psychopharm. (Berl. 177 (1-2), 1-2 (2004).
  4. Cohen, N. J., Memory Eichenbaum, H. . amnesia and the hippocampal system. , (1993).
  5. Strien, N. M., Cappaert, N. L., Witter, M. P. The anatomy of memory: an interactive overview of the parahippocampal-hippocampal network). Nat. Rev. Neurosci. 10 (4), 272-282 (2009).
  6. Agster, K. L., Burwell, R. D. Cortical efferents of the perirhinal, postrhinal and entorhinal cortices of the rat. Hippocampus. 19 (12), 1159-1186 (2009).
  7. Aggleton, J. P. Multiple anatomical systems embedded within the primate medial temporal lobe: implications for hippocampal function. Neurosci. Biobehav. Rev. 36, 1579-1596 (2012).
  8. Robinson, S., Poorman, C. E., Marder, T. J., Bucci, D. J. Identification of functional circuitry between retrosplenial and postrhinal cortices during fear conditioning. J. Neurosci. 32 (35), 12076-12086 (2012).
  9. Bucci, D. J., Saddoris, M. P., Burwell, R. D. Corticohippocampal contributions to spatial and contextual learning. J. Neurosci. 24 (15), 3826-3836 (2004).
  10. Kaut, K. P., Bunsey, M. D. The effects of lesions to the rat hippocampus or rhinal cortex on olfactory and spatial memory: retrograde and anterograde findings. Cogn. Affect. Behav. Neurosci. 1 (3), 270-286 (2001).
  11. Brogden, W. J. Sensory preconditioning. J. Exp. Psychol. 25, 323-332 (1939).
  12. Robinson, S. Chemogenetic silencing of neurons in retrosplenial cortex disrupts sensory preconditioning. J. Neurosci. 34 (33), 10982-10988 (2014).
  13. . NIH guidelines for research involving recombinant or synthetic nucleic acid molecules. Available from: http://oba.od.nih.gov/rdna/nih_guidelines_oba.html. , (2013).
  14. Samulski, R. J., Muzyczka, N. AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes. Annu. Rev. Virol. 1, 427-451 (2014).
  15. Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors. Gene Ther. 3, 545-565 (2003).
  16. Arechavaleta-Velasco, F., Ma, Y., Zhang, J., McGrath, C. M., Parry, S. Adeno-associated virus-2 (AAV-2) causes trophoblast dysfunction, and placental AAV-2 infection is associated with preeclampsia. Am J Path. 168 (6), 1951-1959 (2006).
  17. Erles, K., Rohde, V., Thaele, M., Roth, S., Edler, L., Schlehofer, J. R. DNA of adeno-associated virus (AAV) in testicular tissue and in abnormal semen samples. Hum. Reprod. 16 (11), 2333-2337 (2001).
  18. Donsante, A. AAV vector integration sites in mouse hepatocellular carcinoma. Science. 317 (5837), 477-47 (2007).
  19. Donsante, A. Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors. Gene Ther. 8 (17), 1343-1346 (2001).
  20. Wu, K. Enhanced expression of Pctk1, Tcf12 and Ccnd in hippocampus of rats: impact on cognitive function, synaptic plasticity and. 97 (1), 69-80 (2011).
  21. . National Academy Press. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. National Academy Press. , (1996).
  22. Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial injection of adeno-associated viral vectors. J. Vis. Exp. (45), (2010).
  23. Cavaletti, G. Effect in the peripheral nervous system of systemically administered dimethylsulfoxide in the rat: a neurophysiological and pathological. 119 (1-2), 1-2 (2000).
  24. Parnaudeau, S., et al. Mediodorsal thalamus hypofunction impairs flexible goal-directed behavior. Biol. Psychiatry. 77 (5), 445-453 (2014).
  25. wiki, D. R. E. A. D. D. . , (2014).
  26. Ferguson, S. M., Phillips, P. E. M., Roth, B. L., Wess, J., Neumaier, J. F. Direct-pathway striatal neurons regulate the retention of decision-making strategies. J. Neurosci. 33 (28), 11668-11676 (2013).
  27. Cassatarro, D. Reverse pharmacogenetic modulation of the nucleus accumbens reduces ethanol consumption in a limited access paradigm. Neuropsychopharm. 39, 283-290 (2014).
  28. Krashes, M. J., Shah, B. P., Koda, S., Lowell, B. B. Rapid versus delayed stimulation of feeding by the endogenously released AgRP neuron mediators. GABA, NPY and AgRP. Cell Metab. 18 (4), 588-595 (2014).
  29. Gage, F. H., Bjorklund, A., Stenevi, U., Dunnett, S. B. Functional correlates of compensatory collateral sprouting by aminergic and cholinergic afferents in the hippocampal formation. Brain Res. 268 (1), 39-47 (1983).
  30. Nelson, R. J., Young, K. A. Behavior in mice with targeted disruption of single genes. Neurosci. Biobehav. Rev. 22 (3), 453-462 (1998).

Play Video

Citer Cet Article
Robinson, S., Adelman, J. S. A Method for Remotely Silencing Neural Activity in Rodents During Discrete Phases of Learning. J. Vis. Exp. (100), e52859, doi:10.3791/52859 (2015).

View Video