Метод Дистанционно заставить замолчать нейронной активности в течение Грызуны дискретных фаз обучения

Захватывающая задача в области поведенческой неврологии является определение нейронных субстратов сложным поведением. Количество таких методов, как постоянных поражений, временный инактивации мозга через канюли имплантатов и оптогенетика были использованы для идентификации вклад дискретных областей мозга, чтобы подкомпонентами сложным поведением. Хотя эти подходы наше понимание региональной специфики в ходе обучения, каждый метод не без ограничений. В частности, постоянные поражения, как правило, проводиться до поведенческим тестированием, таким образом, их действие присутствует в течение всего периода парадигмы. Катетеризация исследования, которые включают представление краткосрочной нервной инактиватора (например, тетродотоксин) может производить значительный ущерб ткани мозга и могут вызвать стресс у субъектов только до поведенческого тестирования. Кроме того, инактивации через канюлю ограничено области ткани, которая окружаетКончик канюли. Наконец, в то время как оптогенетика предлагает широкий выбор гибкости для временной контроля деятельности в конкретных областях мозга, она является экономически и технически непомерно требовательных.

Эти ограничения могут быть преодолены с помощью фармакогенетический подход (дизайнер-рецепторов-Исключительно активированные-на-Designer-наркотики, DREADDs) ^1,2. Важно отметить, что в то время как концепция фармакогенетики является сложной, выполнение техники проста. Подобно традиционным стереотаксических хирургических методов, которые включают вливание токсина (например, NMDA, иботеновой кислоты) в дискретных областях головного мозга, этот метод включает привнесение в аденоассоциированный вирус (AAV), который содержит ДНК-фрагмент, модифицированный ингибирующее G-белком рецептор (hM4Di; дизайнер-рецептор) в области интереса стандартных лабораторных грызунов (рисунок 1). Вирусный вектор также содержит флуоресцентный репортер (mcitrine). После того, как включены вк клеткам, проектировщик рецепторов (и репортерный белок) максимально выражены ~ 3 недели после инфузии, и может быть избирательно активированы в течение 2-5 ч при системном введении в противном случае биологически инертного наркотика, клозапин-N-оксида (CNO) ^{1 3.} Потому что экспериментатор наделен точной, но удаленной временной контроль над нервной деятельности в конкретных областях мозга, фармакогенетика сочетает особенно хорошо с поведенческими парадигмами, которые проводятся в несколько этапов. В этом примере, вклад ретроспленальной коры (РКК) на стимул-раздражитель обучение по сравнению с его ролью в павловской обучения, однако это сочетание подходов, хорошо подходит для любого количества вопросов, которые стремятся определить, каким образом конкретные области мозга способствуют сложное поведение.

Кроме того, в то время как не описано в данном протоколе, вирусные и трансгенные подходы могут быть использованы для достижения типа клеток конкретных DREADD выражение ^2. Как и яс присущ поведенческих парадигм, которые включают фармакологические и / или другие типы экспериментальных манипуляций, тщательного рассмотрения эксперимента и последующего количественного анализа требуется при использовании подход DREADD. Экспериментаторы новые для подхода DREADD называют всеобъемлющего обзора современных технологий DREADD ^2.

Каждый день, организмы узнать о новых стимулов и событий и их отношений друг к другу. Даже в знакомой среде, такие как дом, один быстро обнаружить изменения в отношениях между стимулами, потому что эти изменения могут быть предиктором значимых событий. Такой стимул-раздражитель (т.е., реляционная) обучения включает в себя conjoining нескольких стимулов и традиционно ассоциируется с гиппокампе, который находится в центре в медиальной височной доле ^4. Тем не менее, гиппокамп не существует ни действовать в одиночку; области коры как в пределах и внесторона медиальной височной доле обеспечить критическую сенсорную информацию к гиппокампа ^5-7. Традиционные постоянные исследования поражения убедительно доказательства причастности ряда корковых областей (например, ретроспленальной, postrhinal и энторинальной коры) в гиппокампе зависит от обучения, но ограничены в своей способности различать роль конкретного региона в дискретных фаз обучение ^8-10.

Настоящий протокол проверяет гипотезу о том, что РКК необходимо для стимула стимула обучения по замолчать RSC во время одной фазы в 3-фазных сенсорная предварительной подготовки парадигмы ^11,12. Вкратце, крысам настои из AAV, который содержит конструктор рецептор и ~ 3 недели вводят дизайнер наркотиков (CNO) за 30 мин до начала поведенческого тестирования. В настоящем протоколе, экспериментальные крысы получали CNO в ходе первого этапа тестирования (когда стимул-раздражитель ЛирНин происходит), и они получают автомобиль в течение следующих 2 фазы тестирования. Для контроля непреднамеренных последствий CNO на поведение, настоять крыс с дизайнером рецептора (hM4Di) и ввести с автомобиля, а не CNO. Для учета общего влияния вирусной инфузии и экспрессии рецепторов, настоять вирус управления, не содержит конструктор рецептор и управлять CNO.

Ряд различных серотипов AAV используются для доставки генетического материала. Текущие NIH Руководство для исследований с участием рекомбинантных или синтетических молекул утверждает, что AAV (всех серотипов) и рекомбинантных или синтетических AAV конструкции, в которых трансген не кодирует либо потенциально онкогенного генный продукт или молекулы токсина и производятся в отсутствие помощник вирус, требуют BSL-1 предосторожности (Приложение B-1. Группа риска 1 (Rg1) Агенты) ^13. Количество отзывов, относящихся к структуре AAV, полезности и безопасности доступны ^14,15. Примечательно, хотя, Из-за проблем, связанных с возможными репродуктивных ^16,17 и потенциальных канцерогенных механизмов ^18-20 у грызунов, некоторые учреждения требуют использования BSL-2 меры предосторожности при работе с AAV. Убедитесь в правильности BSL до использования путем консультаций с комитетами по надзору в отдельных учреждениях, где проводятся такие исследования, Центры по контролю за заболеваниями и НИЗ Руководства для исследований с участием рекомбинантных ДНК Молекулы ¹³ при использовании вирусных векторов для манипуляции генов в Соединенных Штатах. Личная защита, следователь подготовки, вектор сдерживания, обезвреживание, размещение в очищенных материалов, и после инъекции животных требования на жилье указаны в этих руководящих принципов. Кроме того, консультации и следуйте соответствующей институциональной уходу и использованию животных комитета руководящие принципы или эквивалентные руководящие организационные Комитет по надзору для обеспечения безопасной обработки, управления и распоряжения AAV.