Een methode voor het op afstand zwijgen neurale activiteit in Knaagdieren Tijdens Discrete Fasen van het Leren

Een uitdaging op het gebied van Behavioral Neuroscience is het neurale substraat van complexe gedrag te bepalen. Een aantal technieken zoals permanente laesies, tijdelijke inactivering hersenen via canules implantaten en optogenetics zijn gebruikt om de bijdrage van discrete hersengebieden identificeren subcomponenten van complexe gedragingen. Hoewel deze benaderingen te informeren ons begrip van regionale specificiteit tijdens het leren, elke techniek is niet zonder beperkingen. Specifiek worden permanent laesies gewoonlijk uitgevoerd vóór gedragstesten, waardoor het effect gedurende de duur van het paradigma aanwezig. Canulatie studies dat de presentatie van een korte-termijn neurale inactivator (bijv tetrodotoxin) te betrekken kan aanzienlijke schade aan hersenweefsel te produceren en kan stress in proefpersonen vlak voor gedrags testen induceren. Verder wordt inactivering door middel canulatie beperkt tot het gebied van weefsel dat rond detopje van de canules. Tot slot, terwijl optogenetics biedt een scala van flexibiliteit voor de tijdelijke controle van de activiteit in bepaalde gebieden van de hersenen, het is onbetaalbaar en technisch veeleisend.

Deze beperkingen kunnen worden overwonnen met behulp van een farmacogenetische aanpak (Designer-receptoren Uitsluitend-Activated-by-Ontwerper-Drugs, DREADDs) ^1,2. Belangrijk, terwijl het begrip farmacogenetica is verfijnd, de uitvoering van de techniek is eenvoudig. Vergelijkbaar met traditionele stereotaxische chirurgische methoden die infusie toxine (bijvoorbeeld NMDA, iboteenzuur) in discrete hersengebieden omvat deze techniek infusie een adeno-geassocieerd virus (AAV), die een DNA-fragment dat voor een gemodificeerd remmend G-proteïne gekoppelde receptor bevat betrekken (hM4Di, de ontwerper receptor) in het interessegebied van standaard laboratorium knaagdieren (zie figuur 1). De virale vector bevat ook een fluorescerende reporter (mcitrine). Eenmaal opgenomen incellen, worden de designer receptor (en reporter proteïne) maximaal tot expressie ~ 3 weken na infusie en kan selectief worden geactiveerd voor 2-5 uur met de systemische toediening van de anderszins biologisch inert ontwerperdrug, clozapine-N-oxide (CNO) ^{1 , 3.} Omdat de experimentator is begiftigd met precieze, maar remote temporele controle over de neurale activiteit in bepaalde gebieden van de hersenen, farmacogenetica combineert bijzonder goed met gedragsproblemen paradigma's die worden uitgevoerd in meerdere fasen. In dit voorbeeld is de bijdrage van de retrospleniale cortex (RSC) naar stimulus stimulus learning vergeleken met zijn rol in Pavlov leren evenwel deze combinatie van benaderingen is zeer geschikt om een ​​aantal vragen die proberen te bepalen hoe specifieke hersengebieden bijdragen aan complex gedrag.

Bovendien, terwijl in het onderhavige protocol beschreven, virale en transgene benaderingen kunnen worden gebruikt om type-specifieke cel DREADD expressie ² bereiken. Zoals iks inherent aan gedragsparadigma's die farmacologische en / of andere vormen van experimentele manipulaties, zorgvuldige afweging van proefopzet en daaropvolgende kwantitatieve bepalingsmethoden kunnen nodig bij gebruik van de DREADD benadering. Onderzoekers nieuw voor de DREADD benadering worden verwezen naar een uitgebreid overzicht van de huidige DREADD technologie ^2.

Dagelijks organismen informatie over nieuwe impulsen en gebeurtenissen en hun onderlinge relaties. Zelfs in een vertrouwde omgeving, zoals thuis, men snel veranderingen detecteren in de relatie tussen stimuli, die veranderingen voorspellende betekenisvolle gebeurtenissen zijn. Dergelijke stimulus-stimulus (ie, relationeel) leren betreft de samenvoegende van meerdere stimuli en is van oudsher geassocieerd met de hippocampus, die centraal woont binnen de mediale temporale kwab ^4. Echter, de hippocampus niet bestaat of geïsoleerd optreden; corticale gebieden, zowel binnen als buitenkant van de mediale temporale kwab bieden kritische zintuiglijke informatie naar de hippocampus formatie ^5-7. Traditionele permanent letsel studies dwingend bewijs voor de betrokkenheid van een aantal corticale gebieden (bijvoorbeeld de retrospleniale, postrhinal en entorhinale cortex) in hippocampus-afhankelijk leren, maar zijn beperkt in hun vermogen om de functie van een bepaald gebied te onderscheiden in afzonderlijke fasen leren ^8-10.

Het onderhavige protocol test de hypothese dat de RSC noodzakelijk voor stimulus-stimulus leren door silencing de RSC tijdens een fase van een 3-fasen sensorische preconditionering paradigma ^11,12. In het kort, ratten infusies krijgen van een AAV dat de ontwerper receptor bevat en ~ 3 weken later toegediend de ontwerperdrug (CNO) 30 minuten voor aanvang van gedragsonderzoek. In het huidige protocol, experimentele ratten ontvangt CNO tijdens de eerste fase van het testen (als stimulus-stimulus learning optreedt) en ze het voertuig ontvangt gedurende de volgende 2 fasen van het testen. Om te controleren voor onbedoelde effecten van CNO op het gedrag, bezielen ratten met de ontwerper receptor (hM4Di) en injecteren met het voertuig in plaats van CNO. Om rekening te houden algemene gevolgen van virale infusie en receptor expressie, trekken een controlevirus dat de ontwerper receptor bevat en beheren CNO.

Een aantal verschillende serotypen van AAV worden gebruikt om genetisch materiaal. De huidige NIH richtlijnen voor onderzoek met recombinant of synthetische moleculen stelt dat AAV (alle serotypes) en recombinant of synthetische AAV constructen, waarbij het transgen niet of potentieel tumorigene genproduct of een toxine molecuul coderen en worden geproduceerd in afwezigheid van een helper virus, vereisen BSL-1 voorzorgsmaatregelen (Bijlage B-1. Risk Group 1 (RG1) gemachtigden) ^13. Een aantal beoordelingen met betrekking tot de AAV structuur, het nut en de veiligheid zijn beschikbaar ^14,15. Opmerkelijk is dat de, Als gevolg van bezorgdheid met betrekking tot mogelijke reproductie ^16,17 potentiële carcinogene mechanismen ^18-20 in knaagdieren, sommige instellingen vereisen het gebruik van BSL-2 bij het ​​werken met AAV. Controleer de juiste BSL voor gebruik door overleg met de commissies van toezicht op individuele instellingen waar het onderzoek zal worden uitgevoerd, de Centers for Disease Control en de NIH richtlijnen voor onderzoek met recombinant DNA-moleculen ¹³ bij het ​​gebruik van virale vectoren voor genetische manipulatie in de Verenigde Staten. Persoonlijke bescherming, onderzoeker opleiding, vector insluiting, ontsmetting, de verwijdering van ontsmet materialen, en post-injectie dierverblijven eisen worden gespecificeerd door deze richtlijnen. Bovendien, raadplegen en geschikte Institutional Animal Care en gebruik richtlijnen comité of gelijkwaardige richtlijnen institutionele commissie van toezicht op de veilige behandeling, het beheer en de verwijdering van AAV waarborgen.