This protocol describes how to temporarily and remotely silence neuronal activity in discrete brain regions while rats are engaged in learning and memory tasks. The approach combines pharmacogenetics (Designer-Receptors-Exclusively-Activated-by-Designer-Drugs) with a behavioral paradigm (sensory preconditioning) that is designed to distinguish between different components of learning.
פרוטוקול זה מתאר כיצד באופן זמני ומרחוק כדי להשתיק את הפעילות עצבית באזורי המוח בדידים בעוד בעלי החיים עוסקים במשימות למידה וזיכרון. הגישה משלבת Pharmacogenetics (מעצב-רצפטורים-הופעל באופן בלעדי על ידי מעצב-בסמים) עם הפרדיגמה התנהגות (נפשית מראש חושי) שנועד להבחין בין צורות שונות של למידה. באופן ספציפי, משלוח בתיווך נגיפי משמש להביע קולט G-חלבון מעכב מהונדס גנטי בשילוב (מעצב קולט) לאזור במוח בדיד במכרסמים. שלושה שבועות לאחר מכן, כאשר רמות ביטוי קולט מעצב הן גבוהות, סוכן תרופתי (מעצב התרופות) מנוהל מערכתי 30 דקות לפני פגישת התנהגות ספציפית. יש תרופת זיקה לקולטן מעצב ובכך גורמת לעיכוב של נוירונים המבטאים את הקולטן המעצב, אבל אחרת אינרטי מבחינה ביולוגית. האזור במוח נשאר מושתק במשך 2-5 שעות (depenדינג על המינון ודרך המתן). עם השלמת הפרדיגמה ההתנהגות, רקמת המוח נבחנת למיקום נכון וביטוי הקולטן. גישה זו שימושית במיוחד לקביעת התרומה של אזורים במוח אדם לרכיבים ספציפיים של התנהגות וניתן להשתמש בו על פני כל מספר של פרדיגמות התנהגות.
אתגר מרגש בתחום מדעי מוח התנהגות הוא לקבוע את מצעים העצביים של התנהגויות מורכבות. מספר הטכניקות כגון נגעים קבועים, איון מוח זמני באמצעות שתלי cannulae וoptogenetics להיות מועסק לזהות את תרומתם של אזורים במוח הבדידים למשנה של התנהגויות מורכבות. בעוד גישות אלה להודיע ההבנה ספציפיות האזורי שלנו בלמידה, כל טכניקה היא לא בלי מגבלות. באופן ספציפי, נגעים קבועים מתבצעים בדרך כלל לפני בדיקות התנהגותיות, כך ההשפעות שלהם נמצאות בכל משך הזמן של הפרדיגמה. מחקרי Cannulation שכרוכים בהצגת inactivator טווח קצר עצבי (למשל, tetrodotoxin) יכול לייצר נזק משמעותי לרקמת מוח ויכול לגרום ללחץ בנושאים רק לפני בדיקות התנהגותיות. יתר על כן, איון באמצעות cannulation מוגבל לאזור של רקמה המקיף אתקצה cannulae. לבסוף, בעוד optogenetics מציע מגוון רחב של גמישות לשליטה הזמנית של פעילות באזורי מוח מסוימים, זה העלות ותובענית מבחינה טכנית.
ניתן להתגבר על המגבלות האלה באמצעות גישה pharmacogenetic (מעצב-הופעל באופן בלעדי על ידי מעצב-בסמים רצפטורים, DREADDs) 1,2. חשוב לציין, בזמן שמושג Pharmacogenetics הוא מתוחכם, ביצוע הטכניקה הוא פשוט. בדומה לשיטות ניתוחיות stereotaxic מסורתיים הכוללות עירוי של רעלן (למשל, NMDA, חומצת ibotenic) לאזורים במוח בדידים, טכניקה זו כרוכה בהחדרת וירוס adeno הקשורים (AAV) שמכיל קטע DNA לקולטן G- חלבון מעכב שונה בשילוב (HM4Di; קולט המעצב) לאזור של עניין של מכרסמים מעבדה סטנדרטיים (ראה איור 1). הווקטור הנגיפי מכיל גם כתב ניאון (mcitrine). ברגע שהתאגד בלתאים, קולט המעצב (וחלבון כתב) הם מקסימאלי הביעו ~ 3 שבועות לאחר עירוי-ויכולים להיות מופעל באופן סלקטיבי במשך 2-5 שעות על ידי ממשל מערכתי של תרופת מעצב אחר אינרטי מבחינה ביולוגית, קלוזאפין-N-תחמוצת (CNO) 1 , 3. בגלל ניסוי ניחן בשליטה זמנית מדויקת, עדיין רחוקה מעל הפעילות עצבית באזורים מסוימים במוח, Pharmacogenetics משלב טוב במיוחד עם פרדיגמות התנהגות שנערכות בשלבים מרובים. בדוגמא זו, התרומה של קליפת retrosplenial (RSC) ללמידה בהשוואה לתפקידה בלמידה הפבלובית-גירוי גירוי, לעומת זאת, השילוב של גישות הוא גם מתאים לכל מספר של שאלות שמבקשים לזהות כיצד ספציפי אזורים במוח תורמים ל התנהגות מורכבת.
בנוסף, בזמן שאינו מתואר בפרוטוקול הנוכחי, ניתן להשתמש בגישות ויראלי ומהונדסות כדי להשיג ביטוי DREADD סוג ספציפי תא 2. כפי שים הגלום בפרדיגמות התנהגות שכרוכות תרופתיים ו / או סוגים אחרים של מניפולציות ניסוייות, שיקול זהיר של תכנון ניסוי וניתוח כמותי שלאחר מכן נדרש כאשר העסקת גישת DREADD. הנסיינים חדשים לגישת DREADD מכונים סקירה מקיפה של טכנולוגית DREADD הנוכחית 2.
בכל יום, אורגניזמים ללמוד על גירויים חדשים ואירועים ומערכות היחסים שלהם אחד לשני. גם בסביבה מוכרת, כגון בית, אחד הוא מהיר כדי לזהות שינויים במערכות היחסים בין גירויים, כי שינויים אלה עשויים להיות חזוי של אירועים משמעותיים. גירוי-גירוי כזה (כלומר, יחסים) למידה כרוכה איחוד של גירויים מרובים ובאופן מסורתי נקשר עם ההיפוקמפוס, שמתגורר במרכז בתוך האונה הטמפורלית מדיאלית 4. עם זאת, ההיפוקמפוס אינו קיימת ולא לפעול בבידוד; אזורים בקליפת המוח הן בתוך ומחוץצד של האונה הטמפורלית מדיאלית לספק מידע חושי קריטי להיווצרות בהיפוקמפוס 5-7. מחקרי נגע קבועים מסורתיים לספק ראיות משכנעות למעורבותם של מספר האזורים בקליפת המוח (למשל, הקורטקס retrosplenial, postrhinal וentorhinal) בלמידה בהיפוקמפוס תלוי אך מוגבלים ביכולתם להבחין בתפקיד של אזור מסוים בשלבים בדידים למידת 8-10.
הפרוטוקול הנוכחי בוחן את ההשערה שRSC הכרחי ללמידת גירוי-גירוי על ידי השתקת RSC בשלב אחד של פרדיגמה נפשית מראש חושי 3-שלב 11,12. בקצרה, חולדות לקבל עירויים של AAV שמכיל את הקולטן המעצב ו~ 3 שבועות לאחר מכן מנוהלים סמים מעצב (CNO) 30 דקות לפני תחילת בדיקות התנהגותיות. בפרוטוקול הנוכחי, חולדות ניסוי לקבל CNO במהלך השלב הראשון של בדיקות (כאשר ליר גירוי-גירוינינג מתרחש) והם מקבלים רכב במהלך 2 השלבים הבאים של בדיקות. כדי לשלוט על השפעות מכוונות של CNO על התנהגות, להחדיר חולדות עם קולט המעצב (hM4Di) ולהזריק עם רכב במקום CNO. כדי להסביר את תופעות כלליות של עירוי נגיפי וביטוי הקולטן, להחדיר וירוס שליטה שאינו מכיל את הקולטן המעצב ולנהל CNO.
מספר קפסיד השונים של AAV משמש כדי לספק חומר גנטי. הנחיות NIH הנוכחיות למחקר מעורב רקומביננטי או מולקולות סינטטיים שומרת AAV ש( כל קפסיד) ומבני AAV רקומביננטי או סינטטיים, שבו transgene לא לקודד או מוצר גן פוטנציאל סרטני או מולקולת הרעלן ומיוצרים בהעדר וירוס עוזר, דורש BSL-1 אמצעי זהירות (נספח B-1. סיכון קבוצת 1 (RG1) סוכנים) 13. מספר ביקורות הנוגעות למבנה AAV, שירות ובטיחות זמין 14,15. יש לציין, אם כי, בשל חששות הנוגעים ל16,17 ופוטנציאל מנגנונים אפשריים רבייה מסרטנת 18-20 במכרסמים ל, חלק ממוסדות דורשים שימוש ב- 2 מנהלת הליגה אמצעי זהירות בעת עבודה עם AAV. ודא מנהלת הליגה המתאימה לפני השימוש על ידי התייעצות עם ועדות פיקוח במוסדות בודדים שבי המחקר ייערך, המרכז לבקרת מחלות והנחיות NIH למחקר מעורב רקומביננטי DNA מולקולות 13 בעת שימוש בוקטורים ויראליים למניפולציה גנטית בארצות הברית. הגנה אישית, הכשרת חוקר, בלימת וקטור, טיהור, סילוק חומרי חיטוי, ובעלי חיים לאחר הזרקת דרישות דיור שצוינו על ידי הנחיות אלה. בנוסף, להתייעץ ועיקבו אחרי מוסדי טיפול בבעלי חיים מתאים ובהתאם להנחיות וועדה או הנחיות ועדת ביקורת מוסדיות שווה ערך על מנת להבטיח את הטיפול, הממשל וסילוק של AAV הבטוח.
פרוטוקול זה מתאר כיצד ליישם גישת pharmacogenetic (DREADD) כדי לחקור כיצד אזור ספציפי במוח תורם למשימה למידה מורכבת רב-שלב. עם היכולת באופן זמני ומרחוק כדי להשתיק את הפעילות עצבית באזורי המוח הבדידים פני שלבים של למידה, זה שילוב של גישות מספק פלטפורמה לחקור מגוון רחב של התנהגויו?…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לחברים של רובינסון ואח '. 12 על תרומתם לכתב היד שממנו הפרוטוקול זה נגזר באופן חלקי.
Male, Long Evans Rats, 55-60 d | Hilltop Lab Animals Inc | ||
rAAV8/hSyn-HA-hM4D(Gi)-IRES-mCitrine | Virus Vector Core | Caution: This is a BSL-1 compound | |
rAAV8/hSyn-GFP | Virus Vector Core | Caution: This is a BSL-1 compound | |
Clozapine-N-Oxide | R&D Systems | 4936-10 | Designer Drug |
Rat Cage lid (Polycarbonate) | Alternative Design | FT 8XL-PC | Used to cover animal cages 48-72 hours post infusion |
Filer Paper (Replacement) | Alternative Design | FP-R-1018XAD | Filter paper that goes with cage lids |
Table Top Vise | JETS | 2201-265 | For holding microscentrifuge tubes containing AAV in the hood |
Medline Biohazard liners | Staples | 113444 | Biohazard Trash Bags |
United Solutions 34 gallon rectangular wheeled trashcan with hook and lock handle | Amazon.com | Biohazard Trash Can | |
Isoflurane, 100 mL | Patterson Veterinary Supply Inc. | 07-890-8540 | Anesthetic |
Dual Small Animal Stereotaxic with Digital Display Readout Console | David Kopf | Model 942 | Surgical equipment |
Non-rupture Ear Bars, set of 2 (Rat) | David Kopf | Model 955 | Surgical equipment |
Anesthesia Mask (Rat) | David Kopf | Model 906 | Surgical equipment |
High speed Stereotaxic drill includes table top motor controller, foot pedal, handpiece, stereotaxic handpiece holder | David Kopf | Model 1474 | Surgical equipment |
Microdrill burrs, 0.9 mm | Fine Science Tools Inc | 19007-09 | Surgical supply |
Automated Syringe pump with Micro4 Controller | David Kopf | Model UMP3-1 | Surgical equipment |
Pro-animal detachable Ceramic Blade Clipper Kit | Ahdis | 21420 | Surgical supply |
Betadine Skin Cleanser | Perdue Products L.P | 67618-149-04 | Surgical supply |
Triple Antiobiotic Ointment | Medline Supply | 53329-087-01 | Surgical supply |
Puralube Vet Ointment | Only Veterinary Supply | 17033-211-38 | Surgical supply |
Dino-lite | Microscope | AD7013MTL | An alternative to the traditional disection scope |
Dino-lite Rigid TableTop Boom Stand | Microscope | MS36B | Surgical equipment |
28 Gauge 10uL Syringe | Hamilton | 80308-701SN | Surgical equipment |
Extra Tall MDF Sound attenuating Cubicle | Med Associates, Inc | ENV-018MD | 22'Wx22"Hx16"D |
Extra Tall Modular Test Chamber | Med Associates, Inc | ENV-007 | Behavioral equipment |
Stainless Steel Grid Floor | Med Associates, Inc | ENV-005 | Behavioral equipment |
House Light | Med Associates, Inc | ENV-215M | Used as the house light and stimulus light |
Modular Pellet Dispenser | Med Associates, Inc | ENV-203M-45 | Behavioral equipment |
Pellet Recetacle, Cup Type | Med Associates, Inc | ENV-200R1M | Behavioral equipment |
Head Entry Detector for Rat | Med Associates, Inc | ENV-254-CB | Behavioral equipment |
Dustless precision food pellets, 45 mg | Bio-Serv | F0165 | Behavioral supply |
Cage Speaker for Rat Chamber | Med Associates, Inc | ENV-224AM | Behavioral equipment |
Programmable Audio Generator | Med Associates, Inc | ANL-926 | Behavioral equipment |
Smart Ctrl 8 Input/16 output Package | Med Associates, Inc | DIG-716P2 | Behavioral equipment |
Large Table Top Cabinet and Power Supply | Med Associates, Inc | SG-6510D | Behavioral equipment |
PCI Interface Package | Med Associates, Inc | DIG-700P2-R2 | Behavioral equipment |
MED Intel core Computer Pkg with X Pro 19" Monitor | Med Associates, Inc | COM-103V | Behavioral equipment |
Paraformaldehyde (grannular), 1 kg | Electron Microsopy Sciences | 19210 | Hazard: carcinogen, weigh in hood |
Rabbit Monoclonal antibody (HA-Tag) | Cell Signaling Technologies | 3724S | Histology reagent |
XP Rabbit monoclonal antibody (GFP) | Cell Signaling Technologies | 2956S | Histology reagent |
Anti-Rabbit IgG | Cell Signaling Technologies | 4412S | Histology supplies |
Superfrost Plus slides | VWR international | 483111-703 | Histology supplies |