Ein Verfahren zum Fern Silencing neuronale Aktivität in Nagetiere Während diskreter Phasen des Lernens

Eine spannende Herausforderung auf dem Gebiet der Behavioral Neuroscience ist es, die neuronalen Substrate komplexe Verhaltensweisen zu bestimmen. Eine Anzahl von Techniken, wie beispielsweise Dauer Läsionen, temporäre Gehirn Inaktivierung über Kanülenimplantate und Optogenetik verwendet worden sind, um die Beiträge der einzelnen Gehirnregionen zu Subkomponenten komplexe Verhaltensweisen zu identifizieren. Während diese Ansätze informieren unser Verständnis der regionalen Spezifität beim Lernen, ist jede Technik nicht ohne Einschränkungen. Insbesondere werden Läsionen typischerweise permanent durchgeführt vor der Verhaltenstests, wodurch ihre Wirkung während der gesamten Dauer des Paradigmas vorliegen. Kanülierung Studien, die die Vorlage eines kurzfristigen neuronalen Inaktivator (zB Tetrodotoxin) beinhalten können erhebliche Schäden an Hirngewebe zu produzieren und können Stress bei Patienten kurz vor der Verhaltenstests zu induzieren. Weiterhin wird die Inaktivierung durch Kanülierung in die Region des Gewebes, die die Umgebung begrenztSpitze der Kanülen. Schließlich, während Optogenetik bietet eine Reihe von Flexibilität für die zeitliche Steuerung der Aktivität in bestimmten Hirnregionen, ist es kostspielig und technisch anspruchsvoll.

Diese Einschränkungen können mit einer pharmakogenetischen Ansatz (Designer-Rezeptoren-Exklusiv-Activated-by-Designer-Drogen, DREADDs) ^1,2 überwunden werden. Wichtig ist, dass, während das Konzept der Pharmakogenetik ist anspruchsvoll, ist die Ausführung der Technik unkompliziert. Ähnlich herkömmlichen stereotaktischen chirurgischen Methoden, die Infusion von Toxin (zB NMDA, Ibotensäure) in diskreten Gehirnbereichen beinhaltet diese Technik das Infundieren eines Adeno-assoziierten Virus (AAV), die ein DNA-Fragment für ein modifiziertes inhibitorische G-Protein-gekoppelten Rezeptor enthält beinhalten (hM4Di; der Designer-Rezeptor) in dem interessierenden Bereich von Standard-Labornagern (siehe Abbildung 1). Der virale Vektor enthält auch einen fluoreszierenden Reporter (mcitrine). Einmal in eingeauf Zellen, die Designer-Rezeptor (und Reporterprotein) maximal exprimiert ~ 3 Wochen nach der Infusion und selektiv für 2-5 Stunden nach der systemischen Verabreichung des ansonsten biologisch inert Designerdroge, Clozapin-N-oxid aktiviert werden (CNO) ^{1 , 3.} Weil der Experimentator mit präziser, noch remote zeitliche Kontrolle über neuronale Aktivität in bestimmten Hirnregionen ausgestattet, kombiniert Pharmakogenetik besonders gut mit Verhaltensparadigmen, die in mehreren Phasen durchgeführt werden. In diesem Beispiel ist der Beitrag der retrosplenialen Cortex (RSC) auf einen Reiz-Stimulus Lernen wird zu seiner Rolle bei Pavlovian Lernens verglichen jedoch Kombination dieser beiden Ansätze ist gut geeignet, um eine beliebige Anzahl von Fragen, die zu ermitteln, wie bestimmte Hirnregionen tragen zu suchen komplexes Verhalten.

Darüber hinaus, während in dem vorliegenden Protokoll beschrieben, können virale und transgene Ansätze verwendet werden, um Zelltyp-spezifische Expression DREADD ² zu erzielen. Da ichs eigen Verhaltensparadigmen, die pharmakologischen und / oder andere Arten von experimentellen Manipulationen, sorgfältige Prüfung der Versuchsaufbau und die anschließende quantitative Analyse beteiligt ist erforderlich, wenn unter Verwendung der DREADD Ansatz. Experimentatoren neu in der DREADD Ansatz sind, um eine umfassende Überprüfung der derzeitigen DREADD Technik ² bezeichnet.

Jeden Tag Organismen lernen Sie neue Impulse und Ereignisse und ihre Beziehungen untereinander. Selbst in einer vertrauten Umgebung, wie zu Hause, ist eine schnell zu Veränderungen in den Beziehungen zwischen Reizen zu erkennen, weil diese Änderungen können prädiktiv für sinnvolle Veranstaltungen. Solche Stimulus-Stimulus (dh relational) beinhaltet die Lernzusammengehen mehrerer Reize und ist traditionell mit dem Hippocampus, die zentral innerhalb des medialen Temporallappens ⁴ wohnt in Verbindung gebracht. Allerdings ist der Hippocampus nicht vorhanden, noch isoliert handeln; kortikalen Regionen innerhalb und außerhalbSeite der medialen Temporallappen liefern wichtige sensorische Information an den Hippokampus ^5-7. Traditionelle Permanent Läsion Studien liefern überzeugende Beweise für die Beteiligung einer Reihe von kortikalen Regionen (zB die retrosplenialen, postrhinal und entorhinalen Kortex) in hippocampalen abhängigen Lern sind jedoch in ihrer Fähigkeit, die Rolle eines bestimmten Bereichs bei diskreten Phasen unterscheiden begrenzt Lernen ^8-10.

Das vorliegende Protokoll testet die Hypothese, dass die RSC ist für Stimulus-Stimulus Lernen erforderlich, durch Schweigen den RSC während einer einzelnen Phase einer 3-Phasen-sensorische Präkonditionierung Paradigma ^11,12. Kurz gesagt, erhalten Ratten Infusionen eines AAV, die die Designer-Rezeptor umfasst und ca. 3 Wochen später sind die Designer-Droge (CNO) 30 Minuten vor dem Beginn der Verhaltenstests verabreicht. In dem vorliegenden Protokoll zu empfangen Versuchsratten CNO während der ersten Phase der Prüfung (wenn Stimulus-Stimulus learning auftritt), und sie Fahrzeugs während der nächsten 2 Phasen des Tests unterzogen. Um unbeabsichtigte Auswirkungen der CNO auf Verhalten zu steuern, ziehen Ratten mit dem Designer-Rezeptor (hM4Di) und spritzen mit Fahrzeug statt CNO. Um die für die allgemeine Wirkung von viralen Infusion und Rezeptorexpression Konto, ziehen ein Steuer Virus, das nicht enthält den Designer-Rezeptor und verwalten CNO.

Eine Anzahl von verschiedenen Serotypen von AAV verwendet werden, um genetisches Material zu liefern. Die aktuellen NIH Richtlinien für die Forschung an rekombinante oder synthetische Moleküle behält diese AAV (alle Serotypen) und rekombinante oder synthetische AAV-Konstrukte, in denen das Transgen nicht entweder eine potentiell tumorigenen Genprodukt oder ein Toxinmolekül kodieren, und werden in der Abwesenheit eines erzeugten Helfervirus erfordert BSL-1 Vorsichtsmaßnahmen (Anhang B-1. Risikogruppe 1 (RG1) Agents) ^13. A Anzahl der Bewertungen im Zusammenhang mit AAV-Struktur, Nutzen und Sicherheit sind ^14,15. Bemerkenswert ist, wenn, Aufgrund von Bedenken in Bezug auf mögliche Fortpflanzungs ^16,17 und potenziellen karzinogenen Mechanismen ^18-20 in Nagetieren, einige Institutionen erfordern die Verwendung von BSL-2 Vorsichtsmaßnahmen bei der Arbeit mit AAV. Überprüfen Sie die entsprechende BSL vor durch Rücksprache mit Aufsichtsgremien bei einzelnen Institutionen in denen die Forschung, die Centers for Disease Control und den NIH-Richtlinien für die Forschung an rekombinanten DNA-Moleküle ¹³ bei der Verwendung von viralen Vektoren für die Gen-Manipulation in den Vereinigten Staaten durchgeführt werden, zu nutzen. Personenschutz, Ermittler Ausbildung, Vektor-Containment, Dekontamination, Entsorgung dekontaminiert Materialien und Nacheinspritzung Tierhaltung Anforderungen werden von diesen Leitlinien festgelegt. Darüber hinaus beraten und folgen geeigneten Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss Richtlinien oder gleichwertig institutionellen Aufsichtsgremium Richtlinien, um die sichere Handhabung, Verwaltung und Veräußerung von AAV zu gewährleisten.