Protocolo para propagação de amostras cirúrgicas de glioma de alto grau dissociadas em meio neuroesfera livre de soro para selecionar para células com fenótipo de células-tronco cancerosas. Para espécimes que não crescem como neurosferas, um protocolo alternativo é sugerido. Uma técnica de incorporação de parafina para manter a arquitetura da neurosfera 3D para imunocytoquímica é descrita.
Os glioblastomas, a forma mais comum e agressiva do astrocitoma, são refratários à terapia, e molecularmente heterogêneos. A capacidade de estabelecer culturas celulares que preservem o perfil genômico dos tumores parentais, para uso em modelos in vitro e in vivo específicos do paciente, tem o potencial de revolucionar o desenvolvimento pré-clínico de novos tratamentos para glioblastoma adaptados às características moleculares de cada tumor.
Começando com novos tumores de astrocitoma de alto grau dissociados em células únicas, usamos o ensaio da neurosfera como um método de enriquecimento para células que apresentam fenótipo de células-tronco cancerosas, incluindo expressão de marcadores de células-tronco neurais, auto-renovação de longo prazo in vitro,e a capacidade de formar tumores de xenoenxerto ortotópico. Este método foi previamente proposto, e agora está em uso por vários investigadores. Com base em nossa experiência de dissociar e culminar 125 espécimes de glioblastoma, chegamos ao protocolo detalhado que apresentamos aqui, adequado para a cultura da neurosfera de rotina de astrocitomas de alto grau e expansão em larga escala de células tumorigênicas para estudos pré-clínicos. Relatamos a eficiência de culturas de longo prazo bem sucedidas usando este protocolo e sugerimos alternativas acessíveis para cultivar células dissociadas de glioblastoma que não crescem como neurosferas. Também descrevemos em detalhes um protocolo para preservar a arquitetura 3D das neuroferas para a imunohistoquímica. Culturas celulares enriquecidas em CSCs, capazes de gerar modelos ortotópicos de xenoenxerto que preservam as assinaturas moleculares e a heterogeneidade dos GBMs, estão se tornando cada vez mais populares para o estudo da biologia dos GBMs e para o melhor desenho de testes pré-clínicos de terapias potenciais.
Glioblastoma (GBM), um astrocitoma grau IV da OMS, é o tumor cerebral primário mais prevalente e agressivo. Diversos fenótipos de desenvolvimento são adotados por células tumorais GBM, incluindo células que apresentam características de “células-tronco cancerosas”, como a expressão de marcadores de células-tronco neurais (NSC), a auto-renovação a longo prazo e o potencial de dar origem a células mais diferenciadas expressando marcadores astrócitos e formando a maior parte do tumor1-3. Embora ainda seja necessário esclarecimento sobre a identidade molecular do CSC e as implicações clínicas, o foco do presente trabalho está na definição operacional de CSC: autoconexão de longo prazo in vitro e a capacidade de diferenciar e reproduzir o tumor original após implantação ortotópica em roedores imunocomprometidos.
As células glioblastoma têm sido cultivadas por décadas em meio tradicional contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) e várias altas passagens comercialmente disponíveis linhas celulares GBM cultivadas são tumorigênicas em roedores imunocomprometidos, mas há considerável divergência genômica e molecular do tumor original4, limitando seu uso como modelos clinicamente relevantes. Mais recentemente, foram identificadas células com fenótipo stem/progenitor responsivo ao EGF e bFGF nos GBMs2. Posteriormente, as amostras de tumorES GBM dissociadas foram cultivadas em um meio livre de soro3, originalmente formulado para a seleção e expansão de células-tronco neurais do cérebro adulto mamífero5. Essas condições culturais dificultam o crescimento da maioria das populações de células tumorais não inoplásticas e mais diferenciadas, ao mesmo tempo em que favorecem o crescimento de células-tronco e progenitoras como esferoides multicelulares flutuantes, ou neurosferas3,imitando o comportamento das células-tronco neurais de mamíferos adultos5. Comparação abrangente lado a lado das células GBM primárias cultivadas em ambos os meios da neurosfera suplementadas com fatores de crescimento (NMGF) ou no meio de crescimento tradicional complementadas com 10% de FBS, revelou que as neurosferas GBM eram tumorigênicas, apresentavam potencial de diferenciação multilineagem e preservavam o genótipo do tumor original, em contraste com as culturas de 10% de FBS que não eram tumorigênicas em passagens baixas e divergiram consideravelmente dos tumores originais nas passagens tardias4.
Também foi proposto o isolamento do CSC de tumores GBM dissociados por triagem celular com base na expressão do marcador CSC putativo CD133 também foi proposto6,7, mas outros trabalhos indicaram que o fenótipo CSC não está definitivamente associado à expressão de tais marcadores8-10, diminuindo o entusiasmo inicial para essa estratégia, enquanto novos marcadores ainda estão sendo testados10. A indisponibilidade até o momento de um conjunto validado de marcadores que definem csc, juntamente com o objetivo de amplificação em larga escala dessas células para estudos pré-clínicos, torna o uso de classificação celular impraticável para culturas rotineiras enriquecidas com CSC. Células GBM selecionadas pela capacidade de crescer como neurosferas no NMGF invariavelmente expressam marcadores de células-tronco neurais. Observamos que Sox2 e nestin são onipresentemente expressos em culturas da neurosfera, enquanto a proteína CD133 está presente em um subconjunto das neuroesferas GBM (dados inéditos e referência11).
Vários laboratórios estão buscando culturas neuroferas a partir de tumores glioblastoma usando a mesma abordagem geral de dissociação enzimática e cultivo em meio livre de soro suplementado com fatores de crescimento3,4,11-14, enquanto outros colegas relataram tentativas de cultivar culturas neuroferas de longo prazo a partir de amostras de GBM sem sucesso. O método geral de dissociação enzimática e cultura neurosfera de gliomas de alto grau apresentados aqui é semelhante ao que foi descrito nas publicações acima. Otimizamos o protocolo com base em nossa experiência de dissociar e culminar mais de 100 amostras gbm. A eficiência da obtenção de culturas neuroferas de longo prazo a partir de amostras de GBM frescas aplicando o protocolo aqui apresentado é superior a 40%, semelhante aos poucos relatórios que mostram dados de eficiência3,15, levando à exploração de protocolos alternativos como células de cultivo contínua ou intermitente em meio livre de soro na presença de EGF e bFGF como monocamadas em superfícies revestidas com proteína ECM16,17. As culturas da neurosfera ainda são a abordagem mais validada e cada vez mais popular para preservar os tumores GBM características moleculares e potencial tumorigênico3,4,11-14, portanto nossa abordagem é tentar culturas neuroferas primeiro, enquanto testa concomitantemente métodos alternativos para a cultura de células GBM que não conseguem formar neuroesferas auto-renovadores de longo prazo(Figura 1),para aumentar a representação de tumores GBM que podem ser usados em modelos animais. Aqui apresentamos um protocolo para a cultura de neuroesferas de GBMs. Para as células que não conseguem formar neurosferas, mostramos uma simples modificação no meio de crescimento, como a primeira tentativa de cultivar células tumorigênicas da nonneurosphere formando GBMs, com resultados promissores e ainda passando por ampla validação.
A dissociação adequada das células tumorais enzimáticas é um passo crítico neste protocolo. O tecido deve ser picado bem antes da incubação na solução de dissociação celular a 37 °C em rotação, por um mínimo de 30 min, quando o tecido deve ser triturado mecanicamente e a extensão da dissociação verificada. Dependendo do grau de coesão tecidual, a incubação pode ser estendida por mais 15-30 minutos, conforme necessário para completar a dissociação em células únicas. A incubação na solução de dissociação por mais de 1 hora não é recomendada devido à diminuição da viabilidade celular. Embora a quantidade ideal de tecido inicial seja de 200-500 mgs, este protocolo levou a culturas neuroferas bem sucedidas de apenas 50 mg de tecido tumoral.
O NMGF sem soro é um meio seletivo, e uma porcentagem de células neoplásicas que compõem a maior parte do tumor, bem como as células hospedeiras, não sobreviverão, enquanto outras se ligarão à cultura tecidual tratada após o revestimento. É fundamental que as neurosferas que se formarão ao longo de 1-3 semanas (Figuras 1B-E) sejam transferidas para frascos frescos, para separar-se das células tumorais e detritos diferenciados.
Células GBM enzimáticamente dissociadas e nunca cultivadas (passo 1.10) podem ser criopreservadas como fonte de backup das células para a cultura em mídia alternativa, caso a cultura da neurosfera falhe. Conseguimos com sucesso culturas da neurosfera a partir de tais estoques congelados, bem como células monocamadas crescendo em 2% FBS/NMGF.
Conceitualmente, “célula-tronco do câncer” é um trabalho em andamento e este campo emergente se beneficiará de esclarecimentos adicionais, uma vez que as implicações clínicas são consideráveis, particularmente na geração de heterogeneidade tumoral, plasticidade e resistência à terapia19,20. Além de serem vitais para a geração de modelos animais GBM específicos do paciente, as culturas da neurosfera também são valiosas para estudos in vitro, como alteração na sinalização celular e expressão genética em resposta a fatores de crescimento, hipóxia e agentes farmacológicos11,21. Optamos por utilizar seções transversais de neuroesferas fixas e parafinas, preservando a arquitetura 3D, para estudar a expressão proteica e modificações pós-translacionais por imunohistoquímica11,devido à localização subcelular superior em relação ao método mais comum de rotulagem e imagem de toda a esfera.
Foi demonstrado que nem todas as células dentro das neurosferas derivadas do cérebro adulto são células-tronco22. Da mesma forma, as neuroesferas cultivadas a partir de tumores GBM provavelmente não são clonais, devido à presença de células progenitoras de câncer mais diferenciadas e auto-agregação, conhecida por ocorrer em altas densidades celulares23, o que é considerado uma limitação desse método por alguns. Para favorecer o enriquecimento de células-tronco auto-renovadoraes de longo prazo, em oposição a apenas progenitores que podem crescer transitoriamente como neuroesferas22, as neurosferas primárias são dissociadas para formação da neurosfera secundária, e ainda mais transitadas por um mínimo de 10 passagens, aproximadamente equivalente a 2 meses em cultura contínua, o que é uma indicação de uma população enriquecida em células-tronco22. Em nossa experiência, as culturas da neurosfera GBM que atingem essa marca podem continuar a ser expandidas como neuroesferas indefinidamente. O grau do tumor importa, uma vez que obtivemos culturas bem sucedidas de GBMs e astrócitos anaplásticos, grau IV e III da OMS, respectivamente, mas não de gliomas de menor grau.
O método mais prevalente de cultivar células de glioblastoma, em meio de crescimento tradicional suplementado com 10% de FBS, leva a considerável divergência genômica e fenotípica dos tumores originais 4. Por outro lado, as culturas da neurosfera são uma fonte estável e de longo prazo de células que apresentam fenótipo de células-tronco cancerosas4. O método da neurosfera tornou-se cada vez mais popular para o enriquecimento do CSC em culturas de longo prazo para modelos de xenoenxerto de rato ortotópico, apesar de não ter sido bem sucedido para todas as amostras de astrocitoma de alto grau, o que representa a principal fraqueza deste método. Estudos para entender como as características moleculares dos tumores parentais podem afetar a formação da neurosfera estão em andamento. A exploração de métodos alternativos práticos para a cultura de gliomas de alto grau, seguidas de ampla validação, dadas as vantagens importantes de ter modelos GBM específicos do paciente, à medida que avançamos para uma era de medicina personalizada, alimentada pela acessibilidade de informações “omics” e aumento do número de potenciais terapias-alvo.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pelo Centro de Tumores Cerebrais Hermelin, Hospital Henry Ford.
DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
Trypsin – EDTA 0.05% | Life Technologies | 25300-054 | |
Hank’s Balanced Salt Solution, calcium- and magnesium-free | Life Technologies | 14170-120 | |
Hank’s Balanced Salt Solution, with calcium and magnesium | Life Technologies | 24020-117 | |
Collagenase Type 4 | Worthington | 5004188 | |
Trypsin Inhibitor | Sigma | T7659 | |
DNase I | Sigma | D4527 | |
N2 Supplement (100x) | Life Technologies | 17502-048 | |
Albumin from Bovine Serum, cell culture grade | Sigma | A4919 | |
Gentamicin Reagent Solution | Life Technologies | 15710-064 | |
Antibiotic/Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
Recombinant Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
Lympholyte-Mouse | Cedarlane Laboratories Ltd. | CL5031 | |
Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
Sterile Cell Strainer, 40 μm | Fisher | 22363547 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS), no calcium and no magnesium | Life Technologies | 14190-144 | |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 26140-079 | |
Trypan Blue Stain, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | |
Histoplex Tissue Cassettes | Thermo Scientific | 22-146-426 | |
Rotator | Miltenyi BioTec | 130-090-753 | |
GlutaMAX Supplement | Life Technologies | 35050-061 | |
KnockOut D-MEM/F12 | Life Technologies | 12660-012 | |
Stem Pro Neural Supplement | Life Technologies | A1058-01 |