بروتوكول لنشر العينات الجراحية الورم الدبقي عالية الدرجة المفككة في وسيطة الغلاف العصبي الخالية من المصل لتحديد الخلايا ذات النمط الظاهري للخلايا الجذعية السرطانية. بالنسبة للعينات التي تفشل في النمو كغلاف عصبي ، يقترح بروتوكول بديل. ويرد وصف تقنية تضمين البارافين للحفاظ على العمارة العصبية ثلاثية الأبعاد للكيمياء المناعية.
الأورام الأرومية الدبقية، الشكل الأكثر شيوعا وعدوانية من astrocytoma، هي الانكسار للعلاج، وغير متجانسة جزيئيا. القدرة على إنشاء ثقافات الخلايا التي تحافظ على الملف الجينومي للأورام الأبوية ، لاستخدامها في المختبر المحدد للمريض وفي نماذج الجسم الحي ، لديها القدرة على إحداث ثورة في التطور قبل السريري للعلاجات الجديدة للورم الأرومي الدبقي المصممة وفقا للخصائص الجزيئية لكل ورم.
بدءا من أورام astrocytoma عالية الجودة الطازجة المشتتة إلى خلايا واحدة ، نستخدم المقايسة العصبية كطريقة إثراء للخلايا التي تقدم النمط الظاهري للخلايا الجذعية السرطانية ، بما في ذلك التعبير عن علامات الخلايا الجذعية العصبية ، والتجديد الذاتي على المدى الطويل في المختبر، والقدرة على تشكيل أورام xenograft orthotopic. وقد سبق اقتراح هذه الطريقة، ويستخدمها الآن العديد من المحققين. استنادا إلى تجربتنا في فصل وزراعة 125 عينة من الورم الأرومي الدبقي ، وصلنا إلى البروتوكول التفصيلي الذي نقدمه هنا ، ومناسب لزراعة الغلاف العصبي الروتيني للخلايا الفلكية عالية الجودة والتوسع على نطاق واسع في الخلايا السرطانية للدراسات ما قبل السريرية. نحن نقدم تقريرا عن كفاءة الثقافات الناجحة على المدى الطويل باستخدام هذا البروتوكول واقتراح بدائل بأسعار معقولة لزراعة خلايا الورم الأرومي الدبقي المفككة التي تفشل في النمو كغلاف عصبي. كما نقوم بوصف بروتوكول مفصل للحفاظ على العمارة ثلاثية الأبعاد للكيمياء المناعية. ثقافات الخلايا المخصبة في CSCs، قادرة على توليد نماذج xenograft تقويم العظام التي تحافظ على التوقيعات الجزيئية وعدم التجانس من GBMs، أصبحت شعبية متزايدة لدراسة بيولوجيا GBMs وتحسين تصميم الاختبار قبل السريرية من العلاجات المحتملة.
الورم الأرومي الدبقي (GBM)، وهو ورم فلكي من الدرجة الرابعة من منظمة الصحة العالمية، هو الورم الدماغي الأولي الأكثر انتشارا وعدوانية. يتم اعتماد الأنماط الظاهرية التنموية المتنوعة من قبل الخلايا السرطانية GBM ، بما في ذلك الخلايا التي تظهر خصائص “الخلايا الجذعية السرطانية” (CSC) ، مثل التعبير عن علامات الخلايا الجذعية العصبية (NSC) ، والتجديد الذاتي على المدى الطويل ، وإمكانية إحداث خلايا أكثر تميزا تعبر عن علامات فلكية وتشكل الجزء الأكبر من الورم1-3. في حين لا تزال هناك حاجة إلى توضيح فيما يتعلق بالهوية الجزيئية CSC والآثار السريرية ، فإن تركيز العمل الحالي ينصب على التعريف التشغيلي ل CSC: التجديد الذاتي على المدى الطويل في المختبر والقدرة على تمييز وإعادة إنتاج الورم الأصلي عند زرع تقويم العظام في القوارض المنافرة المناعية.
وقد تم استزراع خلايا الورم الأرومي الدبقي لعقود في الوسط التقليدي الذي يحتوي على 10٪ من مصل الأبقار الجنيني (FBS) والعديد من الممرات العالية المتاحة تجاريا خطوط خلايا GBM المستزرعة في مصل الأورام هي tumorigenic في القوارض المنافرة المناعية ، ولكن هناك اختلاف كبير في الجينوم والجزيئية من الورم الأصلي4، مما يحد من استخدامها كنماذج ذات صلة سريريا. في الآونة الأخيرة، تم تحديد الخلايا ذات النمط الظاهري الجذعية / السلف استجابة لEGF وbFGF في GBMs2. في وقت لاحق، تم زرع عينات الورم GBM فصلها في المتوسط خالية من المصل3،وضعت أصلا لاختيار وتوسيع الخلايا الجذعية العصبية من الدماغ الثدييات الكبار5. هذه الظروف الثقافية تعوق نمو معظم مجموعات الخلايا السرطانية غير البلاستيكية والأكثر تميزا ، مع تفضيل نمو الخلايا الجذعية والذرية كرويدات عائمة متعددة الخلايا ، أو الخلايا العصبية3، تحاكي سلوك الخلايا الجذعية العصبية للثدييات البالغة5. مقارنة شاملة جنبا إلى جنب من الخلايا GBM الأولية المستزرعة في إما الوسط العصبي تكملها عوامل النمو (NMGF) أو في المتوسط النمو التقليدية تكملها مع 10٪ FBS، كشفت أن GBM العصبية كانت tumorigenic، قدمت إمكانات التمايز متعدد الخطوط، والحفاظ على النمط الجيني للورم الأصلي، على النقيض من الثقافات FBS 10٪ التي لم تكن tumorigenic في الممرات المنخفضة وتباينت إلى حد كبير من الأورام الأصلية في الممرات المتأخرة4.
عزل CSC من الأورام GBM فصلها عن طريق فرز الخلايا على أساس التعبير عن المفترض CSC علامة CD133 كما اقترح6,7, ولكن المزيد من العمل أشار إلى أن النمط الظاهري CSC لا يرتبط بشكل قاطع مع التعبير عن مثل هذه العلامات8-10, خفض الحماس الأولي لهذه الاستراتيجية, في حين لا تزال علامات جديدة يجري اختبار10. عدم توفر مجموعة من العلامات التي تم التحقق من صحتها لتحديد CSC حتى الآن ، إلى جانب هدف تضخيم هذه الخلايا على نطاق واسع للدراسات ما قبل السريرية ، يجعل استخدام فرز الخلايا غير عملي للثقافات الروتينية المخصبة ب CSC. خلايا GBM التي تختارها القدرة على النمو كما neurospheres في NMGF تعبر دائما علامات الخلايا الجذعية العصبية. لقد لاحظنا أن Sox2 و nestin يتم التعبير عنها في كل مكان في ثقافات الغلاف العصبي ، في حين أن بروتين CD133 موجود في مجموعة فرعية من الخلايا العصبية GBM (البيانات غير المنشورة والمرجع11).
العديد من المختبرات تسعى الثقافات العصبية من أورام الورم الأرومي الدبقي باستخدام نفس النهج العام للتفكك الأنزيمي وزراعة في المتوسط الخالي من المصل تكملها عوامل النمو3,4,11-14, في حين أبلغ زملاء آخرون محاولات لزراعة الثقافات العصبية على المدى الطويل من عينات GBM دون نجاح . الطريقة العامة للانزيمية الإنزيمية والثقافة العصبية من الأورام الدبقية عالية الجودة المعروضة هنا مماثلة لما تم توضيحه في المنشورات المذكورة أعلاه. لقد قمنا بتحسين البروتوكول بناء على خبرتنا في فصل وزراعة أكثر من 100 عينة GBM. كفاءة الحصول على ثقافات الأعصاب على المدى الطويل من عينات GBM الطازجة تطبيق البروتوكول المعروض هنا هو أكثر من 40٪، على غرار التقارير القليلة التي تظهر كفاءة البيانات3،15، مما يؤدي إلى استكشاف بروتوكولات بديلة مثل زراعة الخلايا باستمرار أو متقطعة في المتوسط خالية من المصل في وجود EGF وbFGF كما monolayers على الأسطح المغلفة بروتين ECM16،17. الثقافات العصبية لا تزال النهج الأكثر صحة وشعبية متزايدة للحفاظ على الخصائص الجزيئية لأورام GBM والإمكانات الورمية3،4،11-14، وبالتالي فإن نهجنا هو محاولة ثقافات الغلاف العصبي أولا ، في حين أن الاختبار المصاحب لطرق بديلة لزراعة خلايا GBM التي تفشل في تشكيل مجالات عصبية ذاتية التجديد على المدى الطويل ( الشكل1) ، لزيادة تمثيل أورام GBM التي يمكن استخدامها في النماذج الحيوانية. هنا نقدم بروتوكولا لزراعة الخلايا العصبية من GBMs. بالنسبة للخلايا التي تفشل في تشكيل الغلاف العصبي ، نظهر تعديلا بسيطا في متوسط النمو ، كأول محاولة زراعة الخلايا السرطانية من الغلاف غير المحيطي التي تشكل GBMs ، مع نتائج واعدة ولا تزال تخضع للتحقق من صحة واسعة النطاق.
إن فصام الخلايا السرطانية الأنزيمية السليم هو خطوة حاسمة في هذا البروتوكول. يجب أن يتم فرم الأنسجة قبل فترة وجيزة من الحضانة في محلول فصيل الخلية عند 37 درجة مئوية تحت الدوران ، لمدة لا تقل عن 30 دقيقة ، عندما يجب أن يكون النسيج متهاتة ميكانيكيا ويتم التحقق من تمديد التفكك. اعتمادا على درجة تماسك الأنسجة، يمكن تمديد الحضانة لمدة إضافية 15-30 دقيقة، حسب الحاجة لإكمال الانفصال إلى خلايا واحدة. لا ينصح باحتضان محلول الانفصال لأكثر من ساعة واحدة بسبب انخفاض صلاحية الخلية. على الرغم من أن الكمية المثلى من الأنسجة البداية هي 200-500 ملغ، وقد أدى هذا البروتوكول إلى الثقافات العصبية الناجحة من أقل من 50 ملغ من أنسجة الورم.
NMGF الخالية من المصل هي وسيلة انتقائية ، ونسبة مئوية من الخلايا البلاستيكية الجديدة التي تضم الجزء الأكبر من الورم ، وكذلك الخلايا المضيفة ، لن تبقى على قيد الحياة ، في حين أن البعض الآخر سيلتصق بقارورة الأنسجة المعالجة بعد الطلاء. ومن الأهمية بمكان أن يتم نقل الخلايا العصبية التي ستشكل أكثر من 1-3 أسابيع(الشكل 1B-E)إلى قوارير جديدة، لفصلها عن الخلايا السرطانية والحطام المتمايز.
يمكن أن تكون خلايا GBM منسدة بشكل أنزيمي ومثقفة أبدا (الخطوة 1.10) كمصدر احتياطي للخلايا للثقافة في وسائل الإعلام البديلة ، في حالة فشل ثقافة الغلاف العصبي. لقد نجحنا في الحصول على ثقافات الغلاف العصبي من هذه المخزونات المجمدة ، وكذلك الخلايا أحادية الطبقة التي تنمو في 2٪ FBS / NMGF.
من الناحية المفاهيمية ، “الخلايا الجذعية السرطانية” هو عمل جار وهذا المجال الناشئ سيستفيد من توضيح إضافي ، لأن الآثار السريرية كبيرة ، خاصة في توليد عدم تجانس الورم ، اللدونة ، ومقاومة العلاج1 9،20. بالإضافة إلى كونها حيوية لتوليد نماذج حيوانية GBM خاصة بالمرضى ، فإن ثقافات الغلاف العصبي ذات قيمة أيضا للدراسات المختبرية مثل التغيير في إشارات الخلايا والتعبير الجيني استجابة لعوامل النمو ونقص الأكسيد والعوامل الدوائية11و21. لقد اخترنا استخدام المقاطع العرضية من الجيوسفيرات العصبية الثابتة والبارافين المضمنة ، والحفاظ على العمارة ثلاثية الأبعاد ، لدراسة التعبير البروتيني والتعديلات اللاحقة للترجمة عن طريق الكيمياء المناعية11، بسبب التعريب شبه الخلوي المتفوق فيما يتعلق بطريقة أكثر شيوعا لوضع العلامات وتصوير الكرة بأكملها.
وقد ثبت أن ليس كل الخلايا داخل neurospheres المستمدة من دماغ الثدييات الكبار هي الخلايا الجذعية22. وبالمثل ، فإن الخلايا العصبية المستزرعة من أورام GBM من المرجح ألا تكون كلونية ، بسبب وجود خلايا سلف سرطان أكثر تمايزا وتجميع ذاتي ، معروف بأنه يحدث في كثافات الخلايا العالية23، وهو ما يعتبر قيدا على هذه الطريقة من قبل البعض. لصالح الإثراء للخلايا الجذعية ذاتية التجديد على المدى الطويل ، بدلا من السلف فقط التي يمكن أن تنمو بشكل عابر كغلاف عصبي22، يتم فصل الغلاف العصبي الأساسي لتكوين الغلاف العصبي الثانوي ، ويتم تمريره لمدة لا تقل عن 10 مقاطع ، أي ما يعادل شهرين تقريبا في الثقافة المستمرة ، وهو مؤشر على إثراء السكان في الخلايا الجذعية22. من خلال تجربتنا ، يمكن أن تستمر ثقافات الغلاف العصبي GBM التي تحقق هذه العلامة في التوسع كغلاف عصبي إلى أجل غير مسمى. درجة الورم مهمة، لأننا حصلنا على ثقافات ناجحة من GBMs وastrocytomas اللاتنسجي، منظمة الصحة العالمية الصف الرابع والثالث، على التوالي، ولكن ليس من الأورام الدبقية من الدرجة الدنيا.
الطريقة الأكثر انتشارا لزراعة خلايا الورم الأرومي الدبقي، في المتوسط النمو التقليدي تكملها 10٪ FBS، يؤدي إلى اختلاف كبير الجينوم و phenotypic من الأورام الأصلية 4. من ناحية أخرى، الثقافات العصبية هي مصدر مستقر وطويل الأجل للخلايا التي تقدم النمط الظاهري للخلايا الجذعية السرطانية4. أصبحت طريقة الغلاف العصبي شعبية متزايدة لإثراء CSC في الثقافات على المدى الطويل لنماذج xenograft الماوس orthotopic، على الرغم من عدم نجاحها لجميع عينات astrocytoma عالية الجودة، والذي يمثل الضعف الرئيسي لهذه الطريقة. تجري دراسات لفهم كيف يمكن للخصائص الجزيئية للأورام الأبوية أن تؤثر على تكوين الغلاف العصبي. يتم منح استكشاف طرق بديلة عملية لثقافة الأورام الدبقية عالية الجودة ، تليها التحقق من صحة واسعة النطاق ، نظرا للمزايا الهامة لوجود نماذج GBM محددة للمريض ، ونحن نتقدم إلى عصر الطب الشخصي ، تغذيه إمكانية الوصول إلى معلومات “omics” وزيادة أعداد العلاجات المستهدفة المحتملة.
The authors have nothing to disclose.
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مركز أورام الدماغ هيرميلين، مستشفى هنري فورد.
DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
Trypsin – EDTA 0.05% | Life Technologies | 25300-054 | |
Hank’s Balanced Salt Solution, calcium- and magnesium-free | Life Technologies | 14170-120 | |
Hank’s Balanced Salt Solution, with calcium and magnesium | Life Technologies | 24020-117 | |
Collagenase Type 4 | Worthington | 5004188 | |
Trypsin Inhibitor | Sigma | T7659 | |
DNase I | Sigma | D4527 | |
N2 Supplement (100x) | Life Technologies | 17502-048 | |
Albumin from Bovine Serum, cell culture grade | Sigma | A4919 | |
Gentamicin Reagent Solution | Life Technologies | 15710-064 | |
Antibiotic/Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
Recombinant Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
Lympholyte-Mouse | Cedarlane Laboratories Ltd. | CL5031 | |
Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
Sterile Cell Strainer, 40 μm | Fisher | 22363547 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS), no calcium and no magnesium | Life Technologies | 14190-144 | |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 26140-079 | |
Trypan Blue Stain, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | |
Histoplex Tissue Cassettes | Thermo Scientific | 22-146-426 | |
Rotator | Miltenyi BioTec | 130-090-753 | |
GlutaMAX Supplement | Life Technologies | 35050-061 | |
KnockOut D-MEM/F12 | Life Technologies | 12660-012 | |
Stem Pro Neural Supplement | Life Technologies | A1058-01 |