在无血清神经球介质中分离出的高档胶质瘤手术标本的传播协议,为具有癌症干细胞表型的细胞进行选择。对于不能作为神经圈生长的标本,建议采取替代方案。描述了一种石蜡嵌入技术,用于维持免疫细胞化学的3D神经球结构。
胶质母细胞瘤是天体细胞瘤最常见和最具有攻击性的形式,对治疗有难治性,在分子上是异质的。建立细胞培养,保持父母肿瘤的基因组特征,用于患者特定 的体外 和 体内 模型的能力,有可能彻底改变针对每个肿瘤的分子特性的胶质母细胞瘤新疗法的药物前开发。
从新的高等级天体细胞瘤肿瘤分离成单细胞开始,我们使用神经球检测作为呈现癌干细胞表型的细胞的丰富方法,包括神经干细胞标记的表达、 体外的长期自我更新以及形成矫形异种移植肿瘤的能力。这种方法以前曾提出过,现在由几位调查人员使用。根据我们分离和培养125个胶质母细胞瘤样本的经验,我们得出了详细的协议,我们在这里提出,适合常规神经圈培养高等级天体细胞和大规模扩张肿瘤细胞的预科研究。我们报告使用此协议的成功长期培养的效率,并建议负担得起的替代培育分离的胶质母细胞,不能成长为神经圈。我们还详细描述了一个保护免疫造血的神经圈3D结构的协议。在CSC中丰富的细胞培养,能够产生能够保存GBM分子特征和异质性的正交异种模型,对于GBM生物学的研究和改进潜在疗法的细胞前测试设计,正变得越来越受欢迎。
胶质母细胞瘤(GBM)是世卫组织IV级天体细胞瘤,是最普遍和最具攻击性的原发性脑肿瘤。GBM肿瘤细胞采用多种发育表型,包括具有”癌症干细胞”(CSC)特征的细胞,如神经干细胞(NSC)标记的表达、长期自我更新,以及产生更多表达星体细胞标记的分化细胞并形成肿瘤1-3的潜力。虽然仍需要澄清CSC分子特性和临床影响,但当前工作的重点是CSC的操作定义: 体外长期自我更新,以及在免疫功能不全啮齿动物的正交植入后分化和复制原肿瘤的能力。
胶质母细胞在传统介质中培养了几十年,含有10%的胎儿牛血清(FBS),几个高通量商业可用的血清培养GBM细胞系在免疫功能低下的啮齿动物中具有肿瘤原发性,但与原始肿瘤4有相当大的基因组和分子差异,限制了它们作为临床相关模型的使用。最近,在GBM2中发现了对EGF和bFGF有反应的干细胞/祖细胞表型。随后,分离的GBM肿瘤样本在无血清介质3中培养,最初用于从成年哺乳动物大脑5中选择和扩展神经干细胞。这些培养条件阻碍了大多数非肿瘤细胞群的生长,同时有利于干细胞和祖细胞的生长,如浮动多细胞球体,或神经球体3,模仿成年哺乳动物神经干细胞的行为5。在神经球介质中培养的原发性GBM细胞的全面并排比较,辅以生长因子(NMGF),或在补充10%FBS的传统生长介质中, 揭示出GBM神经圈具有肿瘤原性,具有多线分化潜力,并保留了原肿瘤的基因型,与10%的FBS培养物形成鲜明对比,后者在低通道时不致肿瘤,在后通道4中与原始肿瘤有较大差异。
CSC与分离的GBM肿瘤通过细胞排序基于假定CSC标记CD133的表达也提出了6,7,但进一步的工作表明,CSC表型没有明确与这种标记的表达8-10,降低最初的热情,这一策略,而新的标记仍在测试10。迄今无法使用一组经验证的标记来定义 CSC,以及大规模放大这些细胞用于细胞前研究的目标,使得对常规 CSC 丰富培养物使用细胞分类不切实际。在NMGF中作为神经球生长的能力选择的GBM细胞总是表达神经干细胞标记。我们观察到,Sox2和巢蛋白在神经圈培养中随处可见,而CD133蛋白存在于GBM神经圈的子集(未公开的数据和参考文献11)中。
一些实验室正在利用同样的酶分离和培养方法,在无血清介质中,辅以生长因子3、4、11-14,从胶质母细胞瘤肿瘤中追求神经球培养,而其他同事则报告说,他们试图从GBM样本中培养长期神经球培养物,但没有成功。这里介绍的高档胶质瘤酶分离和神经球培养的一般方法与上述出版物所概述的方法相似。我们根据分离和培养 100 多个 GBM 样本的经验优化了协议。从应用此处所展示的协议的新鲜GBM样本获得长期神经球培养物的效率超过40%,与显示效率数据3、15的少数报告相似,导致在EGF和bFGF作为单层涂层的表面上涂有ECM蛋白16、17的情况下,不断或间歇性地在无血清介质中培养细胞等替代方案的探索。神经圈培养仍然是保存GBM肿瘤分子特征和肿瘤遗传潜力的最验证和越来越流行的方法3,4,11-14,因此我们的方法是首先尝试神经球培养,同时测试替代方法培育GBM细胞,未能形成长期自我更新的神经圈(图1),以增加GBM肿瘤的代表性,可用于动物模型。在这里,我们提出一个协议,从GBM培养神经球。对于未能形成神经圈的细胞,我们在生长介质上进行了简单的修饰,这是首次尝试从非神经球形成GBM培养肿瘤细胞,结果很有希望,并且仍在进行广泛的验证。
适当的酶肿瘤细胞分离是本协议的关键步骤。在细胞分离溶液在旋转下 37 °C 的孵化之前,组织必须经过切碎,最少 30 分钟,此时组织必须进行机械三次三次修剪,并验证分离的扩展。根据组织凝聚程度,孵化可以延长15-30分钟,以完成分离成单细胞。由于细胞存活率降低,不建议在分离溶液中孵育超过 1 小时。虽然启动组织的最佳量是200-500毫克,但该协议已经导致成功的神经圈培养从只有50毫克的肿瘤组织。
无血清NMGF是一种选择性介质,由肿瘤大部分构成的肿瘤细胞以及宿主细胞的百分比将无法存活,而其他细胞在电镀后将附着在经过处理的烧瓶组织培养物上。至关重要的是,将形成超过1-3周的神经球(图1B-E)转移到新的烧瓶,从分化的肿瘤细胞和碎片分离。
GBM细胞酶分离,从未培养(步骤1.10)可以低温保存作为细胞的备用来源培养在替代媒体,以防神经圈培养失败。我们已经成功地从这些冷冻种群中获得了神经球培养物,以及生长在2%FBS/NMGF中的单层细胞。
从概念上讲,”癌症干细胞”是一项正在进行中的工作,这一新兴领域将受益于额外的澄清,因为临床意义是相当大的,特别是在肿瘤异质性,可塑性和抗治疗19,20的产生。神经圈培养除了对生成特定于患者的GBM动物模型至关重要外,还对体外研究(如细胞信号和基因表达的改变,以应对生长因子、缺氧和药理制剂11、21)等具有价值。由于与更常见的球体标记和成像方法相比,免疫造血术11采用的形式素固定和石蜡嵌入式神经球的横截面,保留了3D结构,研究蛋白质表达和免疫化学11的转化后修饰。
研究表明,并非所有来自成年哺乳动物大脑的神经圈内的细胞都是干细胞。同样,从GBM肿瘤培养的神经球可能不是克隆体,因为存在更分化的癌症祖细胞和自我聚集,已知发生在高细胞密度23,这被认为是这种方法的限制,有些人认为。为了有利于长期自我更新干细胞的富集,而不是仅仅作为神经圈22的祖先,原发性神经球被分离为继发神经球的形成,并进一步通过至少10个通道,大致相当于连续培养2个月,这表明在干细胞22中丰富了人口。根据我们的经验,达到这一标记的GBM神经圈培养可以继续作为神经圈无限期地扩展。肿瘤等级很重要,因为我们分别从GBM和肿瘤性天体、世卫组织四级和三级获得成功的培养,但并非来自低级胶质瘤。
在传统的生长介质中,以10%FBS补充的胶质母细胞培养最普遍的方法,导致与原始肿瘤4的基因组和表型差异相当大。另一方面,神经圈培养是一个稳定和长期的细胞来源,呈现癌症干细胞表型4。神经球方法在正位小鼠异种移植模型的长期培养中,CSC的丰富越来越受欢迎,尽管所有高档天体细胞瘤样本都未成功,但代表了该方法的主要弱点。目前正在进行研究,以了解父母肿瘤的分子特征如何影响神经球的形成。探索培养高等级胶质瘤的实用替代方法,然后进行广泛的验证,因为我们进入一个个性化医学时代,由”omics”信息的可及性和潜在靶向疗法数量增加所推动,具有患者特定的GBM模型的重要优势。
The authors have nothing to disclose.
这项工作由亨利福特医院赫梅林脑肿瘤中心资助。
DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
Trypsin – EDTA 0.05% | Life Technologies | 25300-054 | |
Hank’s Balanced Salt Solution, calcium- and magnesium-free | Life Technologies | 14170-120 | |
Hank’s Balanced Salt Solution, with calcium and magnesium | Life Technologies | 24020-117 | |
Collagenase Type 4 | Worthington | 5004188 | |
Trypsin Inhibitor | Sigma | T7659 | |
DNase I | Sigma | D4527 | |
N2 Supplement (100x) | Life Technologies | 17502-048 | |
Albumin from Bovine Serum, cell culture grade | Sigma | A4919 | |
Gentamicin Reagent Solution | Life Technologies | 15710-064 | |
Antibiotic/Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
Recombinant Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
Lympholyte-Mouse | Cedarlane Laboratories Ltd. | CL5031 | |
Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
Sterile Cell Strainer, 40 μm | Fisher | 22363547 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS), no calcium and no magnesium | Life Technologies | 14190-144 | |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 26140-079 | |
Trypan Blue Stain, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | |
Histoplex Tissue Cassettes | Thermo Scientific | 22-146-426 | |
Rotator | Miltenyi BioTec | 130-090-753 | |
GlutaMAX Supplement | Life Technologies | 35050-061 | |
KnockOut D-MEM/F12 | Life Technologies | 12660-012 | |
Stem Pro Neural Supplement | Life Technologies | A1058-01 |