Protocole pour la propagation des spécimens chirurgicaux à haute teneur dissociés de gliome dans le milieu sans sérum de neurosphère pour sélectionner pour des cellules avec le phénotype de cellules souches cancéreuses. Pour les spécimens qui ne se développent pas en tant que neurosphères, un protocole alternatif est suggéré. Une technique de incorporation de paraffine pour maintenir l’architecture 3D de neurosphère pour immunocytochemistry est décrite.
Les glioblastomes, la forme la plus commune et la plus agressive d’astrocytoma, sont réfractaires à la thérapie, et moléculairement hétérogènes. La capacité d’établir des cultures cellulaires qui préservent le profil génomique des tumeurs parentales, pour une utilisation dans des modèles in vitro et in vivo spécifiques aux patients, a le potentiel de révolutionner le développement préclinique de nouveaux traitements pour le glioblastome adaptés aux caractéristiques moléculaires de chaque tumeur.
En commençant par des tumeurs fraîches d’astrocytome de haut grade dissociées en cellules simples, nous utilisons l’analyse de neurosphère comme méthode d’enrichissement pour les cellules présentant le phénotype de cellule souche cancéreuse, y compris l’expression des marqueurs neuronaux de cellules souches, l’auto-renouvellement à long terme in vitro,et la capacité de former des tumeurs orthotopiques de xénogreffe. Cette méthode a déjà été proposée et est maintenant utilisée par plusieurs chercheurs. Basé sur notre expérience de dissocier et de cultiver 125 spécimens de glioblastoma, nous sommes arrivés au protocole détaillé que nous présentons ici, approprié pour la culture courante de neurosphère des astrocytomas à haute teneur et l’expansion à grande échelle des cellules tumorigènes pour des études précliniques. Nous rendons compte de l’efficacité des cultures à long terme réussies utilisant ce protocole et proposons des alternatives abordables pour la culture des cellules dissociées de glioblastoma qui ne se développent pas comme neurosphères. Nous décrivons également en détail un protocole pour préserver l’architecture 3D des neurosphères pour immunohistochemistry. Les cultures cellulaires enrichies en CSC, capables de générer des modèles de xénogreffe orthotopique qui préservent les signatures moléculaires et l’hétérogénéité des GBM, deviennent de plus en plus populaires pour l’étude de la biologie des GBM et pour l’amélioration de la conception des tests précliniques des thérapies potentielles.
Le glioblastome (GBM), un astrocytome de grade IV de l’OMS, est la tumeur cérébrale primaire la plus répandue et la plus agressive. Divers phénotypes développementaux sont adoptés par les cellules tumorales GBM, y compris les cellules présentant des caractéristiques de « cellules souches cancéreuses » (CSC), telles que l’expression des marqueurs de cellules souches neurales (NSC), l’auto-renouvellement à long terme et le potentiel de donner naissance à des cellules plus différenciées exprimant des marqueurs astrocytaires et formant la majeure partie de la tumeur1-3. Bien que des éclaircissements soient encore nécessaires concernant l’identité moléculaire et les implications cliniques du CSC, le présent travail est axé sur la définition opérationnelle du CSC : l’auto-renouvellement à long terme in vitro et la capacité de différencier et de reproduire la tumeur originale lors de l’implantation orthotopique chez les rongeurs immunodéprimés.
Les cellules de glioblastome ont été cultivées pendant des décennies dans un milieu traditionnel contenant 10% de sérum fœtal bovin (FBS) et plusieurs lignées cellulaires gbm cultivées en sérum à passage élevé disponibles dans le commerce sont tumorigènes chez les rongeurs immunodéprimés, mais il existe une divergence génomique et moléculaire considérable par rapport à la tumeur originale4,limitant leur utilisation en tant que modèles cliniquement pertinents. Plus récemment, des cellules dont le phénotype souche/progéniteur répondait à l’EGF et au bFGF ont été identifiées dans des GBM2. Par la suite, des échantillons dissociés de tumeur GBM ont été cultivés dans un milieu sans sérum3,formulé à l’origine pour la sélection et l’expansion des cellules souches neurales du cerveau des mammifères adultes5. Ces conditions de culture entravent la croissance de la plupart des populations de cellules tumorales non néoplasiques et plus différenciées, tout en favorisant la croissance des cellules souches et progénitrices sous forme de sphéroïdes multicellulaires flottants, ou neurosphères3,imitant le comportement des cellules souches neurales de mammifères adultes5. La comparaison côte à côte complète des cellules primaires de GBM cultivées dans le milieu de neurosphère complété avec des facteurs de croissance (NMGF) ou dans le milieu de croissance traditionnel complété avec 10% FBS, a indiqué que les neurosphères de GBM étaient tumorigènes, a présenté le potentiel de différenciation de multilineage, et a préservé le génotype de la tumeur originale, contrairement aux cultures de 10% de FBS qui n’étaient pas tumorigènes aux bas passages et considérablement divergé des tumeurs originales aux passages tardifs4.
L’isolement du CSC des tumeurs dissociées de GBM par tri cellulaire basé sur l’expression du marqueur csc putatif CD133 a également été proposé6,7,mais d’autres travaux ont indiqué que le phénotype csc n’est pas définitivement associé à l’expression de tels marqueurs8-10,diminuant l’enthousiasme initial pour cette stratégie, tandis que de nouveaux marqueurs sont encore en cours de test10. L’indisponibilité à ce jour d’un ensemble validé de marqueurs définissant le CSC, ainsi que l’objectif d’amplification à grande échelle de ces cellules pour les études précliniques, rend l’utilisation du tri cellulaire peu pratique pour les cultures de routine enrichies de CSC. Les cellules GBM sélectionnées par la capacité de se développer sous forme de neurosphères dans NMGF expriment invariablement des marqueurs de cellules souches neurales. Nous avons observé que Sox2 et la nestine sont omniprésentes dans les cultures de la neurosphère, tandis que la protéine CD133 est présente dans un sous-ensemble des neurosphères GBM (données inédites et référence11).
Plusieurs laboratoires poursuivent des cultures de neurosphère à partir de tumeurs de glioblastome en utilisant la même approche générale de dissociation enzymatique et de culture dans un milieu sans sérum complété par des facteurs de croissance3,4,11-14,tandis que d’autres collègues ont signalé des tentatives de culture de neurosphère à long terme à partir d’échantillons de GBM sans succès. La méthode générale pour la dissociation enzymatique et la culture de neurosphère des gliomes de haut grade présentée ici est semblable à ce qui a été décrit dans les publications ci-dessus. Nous avons optimisé le protocole en fonction de notre expérience de dissociation et de culture de plus de 100 échantillons GBM. L’efficacité de l’obtention de cultures neurosphères à long terme à partir d’échantillons frais de GBM appliquant le protocole présenté ici est supérieure à 40%, similaire aux quelques rapports montrant des données d’efficacité3,15,conduisant à l’exploration de protocoles alternatifs tels que la culture de cellules continuellement ou par intermittence en milieu sans sérum en présence d’EGF et de bFGF en tant que monocouches sur des surfaces recouvertes de protéine ECM16,17. Les cultures de neurosphère sont toujours l’approche la plus validée et de plus en plus populaire pour préserver les caractéristiques moléculaires des tumeurs GBM et le potentiel tumorigène3,4,11-14,donc notre approche est de tenter d’abord des cultures de neurosphères, tout en testant simultanément des méthodes alternatives pour la culture des cellules GBM qui ne parviennent pas à former des neurosphères autorenouvatrices à long terme ( Figure1), pour augmenter la représentation des tumeurs GBM qui peuvent être utilisées dans des modèles animaux. Nous présentons ici un protocole pour la culture des neurosphères des GBM. Pour les cellules qui ne parviennent pas à former des neurosphères, nous montrons une modification simple dans le milieu de croissance, comme la première tentative de culture de cellules tumorigènes à partir de SGB nonneurosphere formant, avec des résultats prometteurs et subissant encore une validation approfondie.
La dissociation enzymatique appropriée de cellules de tumeur est une étape critique dans ce protocole. Le tissu doit être haché bien avant l’incubation dans une solution de dissociation cellulaire à 37 °C en rotation, pendant au moins 30 min, lorsque le tissu doit être trituré mécaniquement et que l’extension de la dissociation doit être vérifiée. Selon le degré de cohésion tissulaire, l’incubation peut être prolongée de 15 à 30 minutes supplémentaires, au besoin, pour compléter la dissociation en cellules individuelles. L’incubation dans une solution de dissociation pendant plus de 1 heure n’est pas recommandée en raison d’une diminution de la viabilité cellulaire. Bien que la quantité optimale de tissu de départ soit mg 200-500, ce protocole a mené aux cultures réussies de neurosphère d’aussi peu que mg 50 de tissu de tumeur.
Nmgf sans sérum est un milieu sélectif, et un pourcentage de cellules néo-plastiques comprenant la majeure partie de la tumeur, aussi bien que les cellules de centre serveur, ne survivra pas, tandis que d’autres se fixeront à la fiole traitée de culture de tissu après placage. Il est essentiel que les neurosphères qui se formeront sur 1 à 3 semaines(figures 1B-E)soient transférées dans des flacons frais, afin de les séparer des cellules tumorales et des débris différenciés.
Les cellules GBM enzymatiquement dissociées et jamais cultivées (étape 1.10) peuvent être cryoconservées comme source de sauvegarde des cellules à la culture dans des milieux alternatifs, au cas où la culture de la neurosphère échouerait. Nous avons obtenu avec succès des cultures de neurosphère à partir de ces stocks congelés, ainsi que des cellules monocouches poussant dans 2% FBS / NMGF.
Conceptuellement, la « cellule souche cancéreuse » est un travail en cours et ce domaine émergent bénéficiera d’une clarification supplémentaire, car les implications cliniques sont considérables, en particulier dans la génération d’hétérogénéité tumorale, de plasticité et de résistance à la thérapie19,20. En plus d’être vitales pour générer des modèles animaux GBM spécifiques au patient, les cultures neurosphères sont également précieuses pour des études in vitro telles que l’altération de la signalisation cellulaire et de l’expression des gènes en réponse aux facteurs de croissance, à l’hypoxie et aux agents pharmacologiques11,21. Nous avons opté pour l’utilisation de coupes transversales de neurosphères fixes au for forine et de paraffine incorporées, en préservant l’architecture 3D, pour étudier l’expression des protéines et les modifications post-traductionnelles par immunohistochimie11, en raison de la localisation subcellulaire supérieure par rapport à la méthode plus courante de étiquetage et d’imagerie de la sphère entière.
Il a été démontré que toutes les cellules des neurosphères dérivées du cerveau de mammifères adultes ne sont pas des cellules souches22. De même, les neurosphères cultivées à partir de tumeurs GBM ne sont probablement pas clonales, en raison de la présence de cellules progénitrices cancéreuses plus différenciées et de l’auto-agrégation, connue pour se produire à des densités cellulaires élevées23, ce qui est considéré comme une limitation de cette méthode par certains. Pour favoriser l’enrichissement pour les cellules souches autorenouvatrices à long terme, par opposition aux progéniteurs qui peuvent se développer transitoirement sous forme de neurosphères22,les neurosphères primaires sont dissociées pour la formation de neurosphères secondaires, et ensuite croisées pendant un minimum de 10 passages, soit à peu près l’équivalent de 2 mois en culture continue, ce qui est une indication d’une population enrichie en cellules souches22. D’après notre expérience, les cultures de neurosphère GBM qui atteignent cette marque peuvent continuer à être étendues en tant que neurosphères indéfiniment. L’importance de catégorie de tumeur, puisque nous avons obtenu les cultures réussies des GBMs et des astrocytomas anaplastiques, la catégorie IV et III d’OMS, respectivement, mais pas des gliomas de qualité inférieure.
La méthode la plus répandue de culture de cellules de glioblastome, dans le milieu de croissance traditionnel complété par 10% FBS, conduit à une divergence génomique et phénotypique considérable par rapport aux tumeurs originales 4. D’autre part, les cultures de neurosphère sont une source stable et à long terme de cellules présentant le phénotype de cellules souchescancéreuses 4. La méthode de neurosphère est devenue de plus en plus populaire pour l’enrichissement du CSC dans les cultures à long terme pour les modèles orthotopiques de xénogreffe de souris, en dépit de ne pas être réussie pour tous les échantillons de haut grade d’astrocytoma, qui représente la faiblesse principale de cette méthode. Des études visant à comprendre comment les caractéristiques moléculaires des tumeurs parentales peuvent affecter la formation de la neurosphère sont en cours. L’exploration de méthodes alternatives pratiques à la culture de gliomes de haut grade, suivie d’une validation approfondie, est accordée, étant donné les avantages considérables d’avoir des modèles gbm spécifiques au patient, alors que nous avançons dans une ère de médecine personnalisée, alimentée par l’accessibilité de l’information « omique » et le nombre accru de thérapies ciblées potentielles.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été financé par le Hermelin Brain Tumor Center de l’hôpital Henry Ford.
DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
Trypsin – EDTA 0.05% | Life Technologies | 25300-054 | |
Hank’s Balanced Salt Solution, calcium- and magnesium-free | Life Technologies | 14170-120 | |
Hank’s Balanced Salt Solution, with calcium and magnesium | Life Technologies | 24020-117 | |
Collagenase Type 4 | Worthington | 5004188 | |
Trypsin Inhibitor | Sigma | T7659 | |
DNase I | Sigma | D4527 | |
N2 Supplement (100x) | Life Technologies | 17502-048 | |
Albumin from Bovine Serum, cell culture grade | Sigma | A4919 | |
Gentamicin Reagent Solution | Life Technologies | 15710-064 | |
Antibiotic/Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
Recombinant Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
Lympholyte-Mouse | Cedarlane Laboratories Ltd. | CL5031 | |
Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
Sterile Cell Strainer, 40 μm | Fisher | 22363547 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS), no calcium and no magnesium | Life Technologies | 14190-144 | |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 26140-079 | |
Trypan Blue Stain, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | |
Histoplex Tissue Cassettes | Thermo Scientific | 22-146-426 | |
Rotator | Miltenyi BioTec | 130-090-753 | |
GlutaMAX Supplement | Life Technologies | 35050-061 | |
KnockOut D-MEM/F12 | Life Technologies | 12660-012 | |
Stem Pro Neural Supplement | Life Technologies | A1058-01 |