혈청이 없는 신경권 배지에서 해리된 고급 신경종 수술 용 시편을 전파하여 암 줄기 세포 표현형을 가진 세포를 선택한다. 신경구로 성장하지 못하는 표본의 경우 대체 프로토콜이 제안됩니다. 면역 세포화학을 위한 3D 신경구 아키텍처를 유지하기 위한 파라핀 임베딩 기술이 설명된다.
성상 세포종, 성상 세포종의 가장 일반적이고 공격적인 형태는 치료에 내화되고, 분자적으로 이질성입니다. 부모 종양의 게놈 프로파일을 보존하는 세포 배양을 확립하는 능력은, 시험관 내 및 생체 내 모델에서 환자특이적 에서 사용하기 위해 각 종양의 분자 특성에 맞는 교모세포종에 대한 새로운 치료법의 전임상 개발에 혁명을 일으킬 가능성이 있다.
단일 세포로 해리된 신선한 고원성 세포종 종양을 시작으로 신경줄기 세포 마커의 발현, 장기자가 재생, 직교 형 이종 종양 형성 능력을 포함하여 암 줄기 세포 표현형을 제시하는 세포를 위한 농축 방법으로 신경권 분석법을 사용합니다. 이 방법은 이전에 제안되었으며 현재 여러 구도자가 사용하고 있습니다. 125개의 교모세포종 표본을 해리하고 배양한 경험을 바탕으로, 우리는 상급 성구 세포종의 일상적인 신경구 배양과 전임상 연구를 위한 종양 성 세포의 대규모 확장에 적합한 상세한 프로토콜에 도착했습니다. 우리는 이 프로토콜을 사용하여 성공적인 장기 배양의 효율성을 보고하고 신경구로 성장하지 못하는 해리된 교모세포종 세포를 배양하기위한 저렴한 대안을 제안합니다. 우리는 또한 면역 작용화학을 위한 신경구 3D 아키텍처를 보존하기 위한 프로토콜을 상세히 기술합니다. GBM의 분자 서명과 이질성을 보존하는 직교 식 이종 이식 모델을 생성 할 수있는 CSC에서 농축 된 세포 배양은 GBM의 생물학 연구와 잠재적 인 치료법의 전임상 테스트의 개선 된 설계에 대한 점점 더 인기를 끌고 있습니다.
교모세포종 (GBM), WHO 등급 IV 성상 세포종, 가장 널리 퍼지고 공격적인 1 차적인 뇌종양입니다. 다양한 발달 표현형은 GBM 종양 세포에 의해 채택되며, 신경 줄기 세포(NSC) 마커의 발현, 장기 자가 갱신 및 성상체 마커를 발현하고 종양1-3의대량을 형성하는 보다 분화된 세포를 초래할 수 있는 가능성과 같은 “암 줄기 세포”(CSC) 특성을 나타내는 세포를 포함하여 채택된다. CSC 분자 정체성 및 임상 적 영향에 대한 설명이 여전히 필요하지만, 현재 작업의 초점은 CSC의 운영 정의에 있습니다 : 시험관내 장기 자체 갱신 및 면역 손상 설치류의 직교 이식시 원래 종양을 분화하고 재현할 수있는 능력.
교모세포종 세포는 10% 태아소 혈청(FBS)을 함유하고 있으며, 여러 고항로가시적으로 이용 가능한 혈청 배양된 혈청 세포주가 면역절량 설치류에서 종양성이지만, 원래 종양4로부터상당한 게놈 및 분자 발산이 있어 임상적으로 관련 모델로서 의사용을 제한하고 있다. 최근에는 EGF 및 bFGF에 반응하는 줄기/선조 표현형을 가진 세포가 GBM2에서확인되었다. 이어서, 해리된 GBM 종양 샘플은 세럼이 없는 배지3에서배양되었고, 원래 는 성인 포유류 뇌로부터 신경 줄기 세포의 선택 및 확장을 위해 제조되었다5. 이러한 배양 조건은 대부분의 비신가소 및 보다 분화된 종양 세포 집단의 성장을 저해하는 한편, 줄기 및 전구 세포의 성장을 부유하는 다세포 구형 구체 또는 신경구3로선호하면서 성인 포유류 신경줄기 세포의 동작을 모방한다5. 성장 인자(NMGF)로 보충된 신경권 배지 또는 10% FBS로 보충된 전통적인 성장 배지에서 배양된 1차 GBM 세포의 종합적인 나란히 비교, GBM 신경구는 종양성, 다중계 분화 잠재력을 제시하고, 원래 종양의 유전자형을 보존하고, 낮은 통로에서 종양생성이 아닌 10% FBS배양과 는 대조적으로, 4후반에 본래 종양과 상당히 갈라졌다는 것을 밝혔다.
CSC마커 CD133의 발현에 기초하여 세포 분류에 의한 GBM 종양으로부터의 CSC의 분리도6,7이제안되었지만, 추가 작업은 CSC 표현형이 이러한마커의발현과 결정적으로 연관되지 않음을 나타내며, 새로운 마커는 여전히10개의검사를 받고 있는 반면, 이러한 마커에 대한 초기 열정을 감소시키고 있다. CSC를 정의하는 검증된 마커 세트의 날짜에 사용할 수 없는 것은 전임상 연구를 위한 이러한 세포의 대규모 증폭을 목표로 하며 일상적인 CSC 농축 배양에 대해 셀 정렬의 사용을 비실용적입니다. NMGF에서 신경구로 성장하는 능력에 의해 선택된 GBM 세포는 변함없이 신경 줄기 세포 마커를 발현한다. 우리는 Sox2와 네신이 신경권 배양에서 유비쿼터스로 발현되는 것을 관찰했으며, CD133 단백질은 GBM 신경구의 하위 집합에 존재합니다 (미공개 된 데이터 및 참조11).
몇몇 실험실은 성장인자로보충된 혈청 없는 매체에서 효소 해리 및 배양의 동일한 일반적인 접근을 사용하여 교모세포종 종양에서 신경권 배양을 추구하고있으며,다른 동료들은 GBM 샘플에서 장기 신경권 배양을 성장시키려는 시도를 성공없이 보고하고 있다. 여기에 제시 된 고급 진종의 효소 해리 및 신경 권 문화에 대한 일반적인 방법은 위의 간행물에 설명 된 것과 유사하다. 우리는 100GBM 샘플을 해리하고 배양한 경험을 바탕으로 프로토콜을 최적화했습니다. 여기에 제시된 프로토콜을 적용한 신선한 GBM 샘플로부터 장기 신경권 배양을 얻는 효율은 40% 이상이며, 효율성데이터3,15를나타내는 몇 가지 보고서와 유사하며, EGF 및 bFGF가 표면에 단층으로 코팅된 표면 17, 17의 단층으로 혈청 없는 배지에서 지속적으로 또는 간헐적으로 배양하는 것과 같은 대체 프로토콜의 탐구로이어진다. 신경권 배양은 여전히 GBM 종양의 분자 특성과 종양성 전위3,4,11-14를보존하기 위한 가장 검증되고 점점 더 대중적인 접근법이며, 따라서 우리의 접근 방식은 신경권 배양을 먼저 시도하는 한편, 장기간자가 갱신하는 신경구를 형성하지 못하는 GBM 세포를 배양하기 위한 대체 방법을 수반하는 한편(그림1)은동물학적 세포의 표현을 증가시킬 수 있다. 여기에서 우리는 GBM에서 신경구를 배양하기위한 프로토콜을 제시합니다. 신경구를 형성하는 데 실패한 세포의 경우, 우리는 비 신경권 형성 GBM에서 종양 성 세포를 배양하는 첫 번째 시도로 성장 배지에 간단한 수정을 보여주고 유망한 결과를 초래하고 여전히 광범위한 검증을 받고 있습니다.
적절한 효소 종양 세포 해리는 이 프로토콜에서 중요한 단계입니다. 조직은 37°C의 회전 하에서 세포 해리용액의 배양 전에 잘 절단되어야 하며, 최소 30분 동안, 조직이 기계적으로 삼각화되어야 하고 해리의 연장이 검증되어야 한다. 조직 응집력의 정도에 따라, 배양을 추가로 연장할 수 있습니다 15-30 분, 단일 세포로 해리를 완료 하는 데 필요한. 1시간 이상 해리 용액의 배양은 세포 생존가능성이 저하되어 권장되지 않는다. 시작 조직의 최적 양은 200-500 mg이지만,이 프로토콜은 종양 조직의 50 mg의 작은에서 성공적인 신경 권 배양으로 이어졌습니다.
혈청이 없는 NMGF는 선택적 배지이며, 종양의 대부분을 포함하는 신플라스틱 세포의 백분율뿐만 아니라 숙주 세포는 생존되지 않을 것이며, 다른 세포는 도금 후 플라스크처리된 조직 배양에 부착될 것이다. 1-3주 이상 형성될 신경구(그림1B-E)는분화된 종양 세포및 이물질과 분리하기 위해 신선한 플라스크로 옮겨지는 것이 중요합니다.
GBM 세포는 신경권 배양에 실패할 경우, 효소적으로 해리되고 배양되지 않은(step 1.10)을 대체 매체에서 배양하는 세포의 백업 원천으로서 냉동 보존될 수 있다. 우리는 성공적으로 2 % FBS / NMGF에서 성장하는 단층 세포뿐만 아니라 이러한 냉동 주식에서 신경 권 배양을 얻었다.
개념적으로, “암 줄기 세포”는 진행 중인 작업이며, 이러한 신흥 분야는 임상적 영향이 상당하기 때문에, 특히 종양 이질성, 가소성 및 치료에 대한 내성19,20에대한 내성에서 상당한 영향을 미치기 때문에 추가적인 해명에서 유익할 것이다. 환자 별 GBM 동물 모델을 생성하는 데 중요한 것 외에도, 신경권 배양은 성장 인자, 저산소증 및 약리학제(11,21)에반응하여 세포 신호 및 유전자 발현의 변경과 같은 체외 연구에도 유용하다. 우리는 포르말린 고정 및 파라핀 임베디드 신경권의 단면을 사용하여 3D 아키텍처를 보존하고, 면역 조직화학(11)에의한 단백질 발현 및 번역 후 변형을 연구하기로 결정했습니다.
성인 포유류 뇌에서 유래된 신경구 내의 모든 세포가줄기세포(22)인것은 아니라는 것이 나타났다. 유사하게, GBM 종양으로부터 배양된 신경구는 복제되지 않을 가능성이 있으며, 이는 더 분화된 암 전구 세포 및 자가 응집의 존재로 인해, 높은 세포밀도(23)에서발생하는 것으로 알려져 있으며, 이는 이 방법의 한계로 간주된다. 신경권(22)으로일시적으로 성장할 수 있는 전월체와 는 달리, 장기자가 자가갱신줄기세포를 농축하는 것을 선호하기 위해, 1차 신경구는 이차 신경구 형성을 위해 해리되고, 줄기세포에서인구가 풍부해지는 2개월에 해당하는 10개의 구절을 더 통과한다. 우리의 경험에서, 그 표시를 달성하는 GBM 신경권 문화는 신경구로 무기한 확장될 수 있습니다. 종양 등급은 우리가 GBM과 아나플라스틱 성체 세포종에서 성공적인 배양을 얻었기 때문에, WHO 등급 IV와 III, 각각, 그러나 낮은 학년 진모에서.
교모 세포종을 배양하는 가장 널리 퍼진 방법은, 10% FBS로 보충된 전통적인 성장 배지에서, 본래 종양 4에서상당한 게놈 및 현상변 발산으로 이끌어 냅니다. 한편, 신경권 배양은 암줄기세포 표현형4를제시하는 세포의 안정적이고 장기적인 공급원이다. 신경권 방법은 이 방법의 주요 약점을 나타내는 모든 고급 성상세포종 샘플에 성공하지 못했음에도 불구하고, 치열 류 마우스 이종이식 모델에 대한 장기 배양에서 CSC의 농축에 대한 점점 더 인기를 끌고있다. 부모 종양의 분자 특성이 신경권 형성에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 이해하는 연구가 진행중입니다. “omics” 정보의 접근성과 잠재적 표적 치료의 증가에 힘입어 개인화된 의학의 시대로 발전함에 따라 환자 특정 GBM 모델을 갖는 중대한 이점을 감안할 때, 고급 진교를 배양하는 실용적인 대체 방법의 탐구가 부여됩니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 헤르멜린 뇌종양 센터, 헨리 포드 병원에 의해 투자되었습니다.
DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
Trypsin – EDTA 0.05% | Life Technologies | 25300-054 | |
Hank’s Balanced Salt Solution, calcium- and magnesium-free | Life Technologies | 14170-120 | |
Hank’s Balanced Salt Solution, with calcium and magnesium | Life Technologies | 24020-117 | |
Collagenase Type 4 | Worthington | 5004188 | |
Trypsin Inhibitor | Sigma | T7659 | |
DNase I | Sigma | D4527 | |
N2 Supplement (100x) | Life Technologies | 17502-048 | |
Albumin from Bovine Serum, cell culture grade | Sigma | A4919 | |
Gentamicin Reagent Solution | Life Technologies | 15710-064 | |
Antibiotic/Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
Recombinant Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
Lympholyte-Mouse | Cedarlane Laboratories Ltd. | CL5031 | |
Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
Sterile Cell Strainer, 40 μm | Fisher | 22363547 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS), no calcium and no magnesium | Life Technologies | 14190-144 | |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 26140-079 | |
Trypan Blue Stain, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | |
Histoplex Tissue Cassettes | Thermo Scientific | 22-146-426 | |
Rotator | Miltenyi BioTec | 130-090-753 | |
GlutaMAX Supplement | Life Technologies | 35050-061 | |
KnockOut D-MEM/F12 | Life Technologies | 12660-012 | |
Stem Pro Neural Supplement | Life Technologies | A1058-01 |