無血清神経球培地における解離された高等度神経膠腫外科標本の伝播のためのプロトコルは、癌幹細胞表現型を有する細胞に対して選択する。神経球として成長できない標本については、代替プロトコルが提案される。免疫細胞化学のための3D神経球アーキテクチャを維持するためのパラフィン埋め込み技術について説明する。
神経膠芽腫は、最も一般的で攻撃的な形態の星細胞腫であり、治療に難治性であり、分子的に不均一である。患者固有の in vitro および in vivo モデルで使用するために、親の腫瘍のゲノムプロファイルを維持する細胞培養を確立する能力は、各腫瘍の分子特性に合わせた神経膠芽腫の新しい治療法の前臨床開発に革命をもたらす可能性を有する。
単一細胞に解き明かされた新鮮な高等位の星細胞腫腫瘍から始まり、神経幹細胞マーカーの発現、 インビトロでの長期自己再生、異形移植腫瘍の形成能など、がん幹細胞表現型を呈する細胞の濃縮方法として神経球アッセイを用いる。この方法は以前に提案されており、現在は複数の調査員によって使用されています。125個の神経膠芽腫標本の解離と培養の経験に基づいて、我々は高グレードの星状細胞腫の日常的な神経球培養および前臨床試験のための腫瘍形成細胞の大規模な拡張に適した詳細なプロトコルに到着しました。我々は、このプロトコルを用いて成功した長期培養の効率を報告し、神経球として成長できない解解化神経膠芽腫細胞を培養するための手頃な価格の選択肢を提案する。また、免疫体系化学のためのニューロスフィア3Dアーキテクチャを保存するためのプロトコルについても詳細に説明する。CSCsに富んだ細胞培養は、GBMの分子シグネチャと不均一性を維持する同位体異種移植モデルを生成することができ、GBMの生物学の研究や潜在的な治療法の前臨床試験の改善された設計のためにますます人気が高まっています。
神経膠芽腫(GBM)は、WHOグレードIVアストロサイトマであり、最も一般的で積極的な原発性脳腫瘍である。GBM腫瘍細胞では、神経幹細胞(NSC)マーカーの発現などの「がん幹細胞」(CSC)特性を示す細胞を含む多様な発生表現型が採用されており、長期自己再生、および天体マーカーを発現し、腫瘍の大部分を形成してより分化した細胞を生み出す可能性がある。CSC分子同一性と臨床的影響に関しては依然として明確化が必要であるが、本研究の焦点は、CSCの運用定義である、 インビトロでの長期的な自己再生と、免疫不全げ歯ぎぎげの中の異形移植時に元の腫瘍を分化し、再生する能力である。
神経膠芽腫細胞は、10%のウシ胎児血清(FBS)を含む伝統的な培地で何十年も培養されており、市販のいくつかの高い通路の血清培養GBM細胞株は免疫不全げ歯類において腫瘍性であるが、元の腫瘍4からかなりのゲノムおよび分子乖離があり、臨床的に関連するモデルとしての使用を制限している。最近では、EGFおよびbFGFに応答する幹細胞/前駆体表現型を有する細胞がGBM2で同定された。続いて、脱離したGBM腫瘍試料を無血清培地3で培養し、もともと成人哺乳動物脳5から神経幹細胞の選択及び拡張のために処方した。これらの培養条件は、ほとんどの非新生物およびより分化された腫瘍細胞集団の増殖を妨げる一方で、多細胞スフェロイド、または神経球3の浮遊として幹細胞および前駆細胞の増殖を支持する一方で、成人哺乳類神経幹細胞5の挙動を模倣する。成長因子(NMGF)を添加した神経球培地(NMGF)または10%FBSを添加した伝統的な成長培地のいずれかで培養された一次GBM細胞の包括的な並び GBM神経球は腫瘍性であり、多系統分化の可能性を提示し、元の腫瘍の遺伝子型を保存し、低い通路で腫瘍化せず、後期節で元の腫瘍からかなり発散した10%のFBS培養物とは対照的に4。
CSCマーカーCD133の発現に基づく細胞選別による解離されたGBM腫瘍からのCSCの分離も6,7で提案されているが、さらなる研究により、CSC表現型がそのようなマーカー8-10の発現と決定的に関連していないことを示したが、新しいマーカーは依然として10の新しいマーカーの初期の熱意を低下させる。CSCを定義する検証されたマーカーのセットの現在までに利用できない、前臨床試験のためにこれらの細胞の大規模な増幅の目標と共に、細胞の並べ替えの使用は日常的なCSC濃縮培養には実用的ではありません。NMGFにおいて神経球として増殖する能力によって選択されるGBM細胞は、神経幹細胞マーカーを必ず発現する。我々は、Sox2およびnestinが神経球培養において遍在的に発現し、CD133タンパク質はGBM神経球のサブセットに存在することを観察した(未発表データおよび参照11)。
いくつかの研究室では、成長因子3、4、11-14を補った無血清培地における酵素解離と培養の同じ一般的アプローチを用いて神経膠芽腫腫瘍から神経球培養を進めているが、他の同僚はGBMサンプルから長期的な神経球培養を成功させずに成長させようとする試みを報告している。ここで提示される高品位神経膠腫の酵素解離および神経圏培養の一般的な方法は、上記の出版物で概説されているものと類似している。100 GBM以上のサンプルの解離と培養の経験に基づいてプロトコルを最適化しました。ここで提示されるプロトコルを適用する新鮮なGBMサンプルから長期神経球培養物を得る効率は40%を超え、効率データ3、15を示すいくつかの報告と同様に、EGFおよびbFGFの存在下で細胞を血清フリー培地中で継続的または断続的に培養する代替プロトコルの探索につながる。神経球培養は、GBM腫瘍の分子特性と腫瘍発生の可能性を維持するための最も検証され、ますます普及しているアプローチである3、4、11-14であり、したがって、我々のアプローチは、長期的に自己更新神経球を形成しないGBM細胞を培養するための代替方法を一度にテストしながら、最初に神経圏培養を試みるものであり、動物モデルで使用できるGBM腫瘍の表現を高めることである。ここでは、GBMから神経球を培養するためのプロトコルを提示します。神経球を形成できない細胞については、GBMを形成する非神経球から腫瘍性細胞を培養する最初の試みとして、成長培地の単純な改変を示し、有望な結果を得て、依然として広範な検証を受けている。
適切な酵素腫瘍細胞解離は、このプロトコルの重要なステップです。組織は、37°Cの回転下で細胞解離液中でインキュベーションする前に、組織を機械的に三分引きし、解離の延長を確認する必要がある場合、最低30分間ミンチする必要があります。組織凝集の程度に応じて、インキュベーションは、単一細胞への解離を完了するために必要に応じて、さらに15〜30分間延長することができる。細胞の生存率の低下により、解離液中の1時間以上のインキュベーションは推奨されません。開始組織の最適な量は200〜500mgであるが、このプロトコルは、腫瘍組織のわずか50mgから成功した神経球培養につながっている。
無血清NMGFは選択的培地であり、腫瘍の大部分、ならびに宿主細胞を含む腫瘍の腫瘍細胞の割合は生き残らず、他のものはめっき後にフラスコ処理した組織培養に付着する。1~3週間にわたって形成される神経球(図1B-E)は、分化した腫瘍細胞および破片から分離するために、新鮮なフラスコに移されることが重要である。
GBM細胞は、神経圏培養が失敗した場合に、細胞を代替培地で培養するバックアップ源として、酵素的に解約し、培養しない(ステップ1.10)培養することができる。このような冷凍株から神経圏培養物を得るとともに、FBS/NMGFの2%で増殖する単層細胞も得ています。
概念的には、「癌幹細胞」は進行中の作業であり、この新たな分野は、臨床的な意味合いがかなり、特に腫瘍不均一性、可塑性、および治療19、20に対する耐性の生成においてかなりのものであるため、さらなる解明の恩恵を受けるだろう。神経圏培養は、患者固有のGBM動物モデルの生成に不可欠であることに加えて、成長因子、低酸素、および薬理学的薬剤11,21に応答して細胞シグナル伝達および遺伝子発現の変化などのインビトロ研究にも有用である。我々は、ホルマリン固定及びパラフィン組み込み神経球の断面を使用して、3Dアーキテクチャを維持し、免疫体化学11によるタンパク質発現および翻訳後修飾を研究することを選択した。
成人哺乳類の脳由来の神経球内の細胞のすべてが幹細胞であるわけではないことが示されている。同様に、GBM腫瘍から培養された神経球はクローン性ではない可能性が高く、より分化された癌前駆細胞および自己凝集の存在に起因して、高細胞密度23で生じることが知られており、これはこの方法の制限と考えられている。長期自己再生幹細胞の濃縮を支持するために、神経球22として一過性に成長できる前駆物質とは対照的に、一次神経球は二次神経球形成のために解離され、さらに10の通路をさらに10個の通路に分けて、幹細胞に富んだ集団の指標である。私たちの経験では、そのマークを達成するGBM神経球文化は、神経球として無期限に拡大し続けることができます。腫瘍グレードは、GBMおよび再生不良星細胞腫、WHOグレードIVおよびIIIからそれぞれ成功した培養を得ているが、低グレードの神経膠腫からは得られていないので、問題である。
神経膠芽腫細胞を培養する最も一般的な方法は、10%FBSを添加した伝統的な成長培地において、元の腫瘍4からかなりのゲノムおよび形質転換をもたらす。一方、神経球培養は、癌幹細胞表現型4を提示する細胞の安定かつ長期的な供給源である。神経球法は、この方法の主な弱点を表すすべての高等級アストロサイトーマサンプルに対して成功していないにもかかわらず、直交性マウス異種移植片モデルの長期培養におけるCSCの濃縮にますます人気が高まっている。親腫瘍の分子特性が神経球形成に及ぼす影響を理解するための研究が進められている。「オミックス」情報のアクセシビリティと潜在的な標的療法の数の増加に伴い、パーソナライズされた医療の時代に進むにつれて、患者固有のGBMモデルを持つことの重大な利点を考えると、培養高等度の神経膠腫に対する実用的な代替方法の探求、続いて広範な検証が認められる。
The authors have nothing to disclose.
この研究は、ハーメリン脳腫瘍センター、ヘンリーフォード病院によって資金提供されています。
DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
Trypsin – EDTA 0.05% | Life Technologies | 25300-054 | |
Hank’s Balanced Salt Solution, calcium- and magnesium-free | Life Technologies | 14170-120 | |
Hank’s Balanced Salt Solution, with calcium and magnesium | Life Technologies | 24020-117 | |
Collagenase Type 4 | Worthington | 5004188 | |
Trypsin Inhibitor | Sigma | T7659 | |
DNase I | Sigma | D4527 | |
N2 Supplement (100x) | Life Technologies | 17502-048 | |
Albumin from Bovine Serum, cell culture grade | Sigma | A4919 | |
Gentamicin Reagent Solution | Life Technologies | 15710-064 | |
Antibiotic/Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
Recombinant Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
Lympholyte-Mouse | Cedarlane Laboratories Ltd. | CL5031 | |
Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
Sterile Cell Strainer, 40 μm | Fisher | 22363547 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS), no calcium and no magnesium | Life Technologies | 14190-144 | |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 26140-079 | |
Trypan Blue Stain, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | |
Histoplex Tissue Cassettes | Thermo Scientific | 22-146-426 | |
Rotator | Miltenyi BioTec | 130-090-753 | |
GlutaMAX Supplement | Life Technologies | 35050-061 | |
KnockOut D-MEM/F12 | Life Technologies | 12660-012 | |
Stem Pro Neural Supplement | Life Technologies | A1058-01 |