Proliferação e diferenciação de murino Precursor mieloide 32G/G-CSF-R células
Summary
Apresentam-se aqui detalhados protocolos para a linha de celular de 32G/G-CSF-R precursor mieloide murino de cultivo, realizando a infecções virais e realizar ensaios de proliferação e diferenciação. Esta linha de celular é adequada para estudar o desenvolvimento de células mieloides e o papel dos genes de interesse no crescimento de células mieloides e diferenciação neutrofílica.
Abstract
Compreensão da hematopoiética estaminais e progenitor da biologia das células tem implicações importantes para o tratamento de patologias hematológicas e medicina regenerativa. Apesar dos dados mais relevantes que podem ser adquiridos usando modelos na vivo ou culturas primárias, a baixa abundância de células estaminais e progenitoras hematopoiéticas restringe consideravelmente a piscina de técnicas adequadas para sua investigação. Portanto, o uso de linhas celulares permite produção suficiente de material biológico para o desempenho das seleções ou ensaios que requerem números de células grandes. Aqui apresentamos uma descrição detalhada, leitura e interpretação de ensaios de proliferação e diferenciação, que são utilizados para a investigação dos processos envolvidos na myelopoiesis e diferenciação neutrofílica. Estas experiências empregam a linha de célula mieloide murino dependente de citocinas 32G/G-CSF-R, que possui a habilidade de se proliferam na presença de IL-3 e se diferenciam em G-CSF. Nós fornecemos otimizado de protocolos para a manipulação de células de 32G/G-CSF-R… e discutir as principais armadilhas e inconvenientes que possam comprometer os ensaios descritos e os resultados esperados. Além disso, este artigo contém protocolos para produção de Lentivirus e retroviral, titulação e transdução de células de 32G/G-CSF-R. Demonstramos que manipulação genética destas células pode ser empregada com sucesso realizar estudos moleculares e funcionais, que podem complementar os resultados obtidos com primárias células tronco e progenitoras hematopoiéticas ou modelos na vivo .
Introduction
A população de tronco e progenitoras hematopoiética fornece o organismo com uma grande variedade de células maduras, incluindo as células da linhagem mieloide (neutrófilos, eosinófilos, basófilos e monócitos). O processo que conduz à produção de células mieloides das pilhas de haste hematopoietic é conhecido como myelopoiesis, e produção adequada de células mieloides maduras, em resposta às novas demandas é um pré-requisito para o enfrentamento adequado do organismo com o stress condições, tais como infecções e perda de sangue. Produção insuficiente de células mieloides maduras pode levar à incapacidade de eliminar os agentes patogénicos, coagulação sanguínea reduzida e outros fatais condições1,2. Além disso, alterações no desenvolvimento da linhagem mieloide podem também ser associadas com malignidades hematológicas, como a leucemia mieloide aguda (LMA)3. Alterações no myelopoiesis podem ocorrer devido a várias razões, tais como defeitos no celular receptores de superfície4, expressões alterados de fatores de transcrição5, prejudicados de vias de sinalização6, mutações, resultando na formação / ativação de oncogenes7ou inactivação do tumor supressor genes8.
Vários métodos foram desenvolvidos para estudar o desenvolvimento mieloide e avaliar o efeito de alterações genéticas específicas neste processo. Abordagens comuns usadas para estudar myelopoiesis envolvem as células primárias e ratos transgénicos. Embora estes modelos permitem a aquisição de dados biologicamente relevantes, eles têm certas limitações. O uso de células primárias encontra um número limitado de células e um período restrito da cultura, estreitando as possibilidades para alterar a expressão gênica e posterior análise biológica ou bioquímica. Camundongos transgênicos são caros e exigem um grau razoável de justificação biológica. Além disso, trabalho com modelos em vivo adiciona um grau de complexidade em compreender o papel de um gene de interesse em um determinado processo. Portanto, abordagens alternativas para contornar essas limitações são necessários. Linhas celulares têm vantagens indiscutíveis: (1) eles possuem capacidade de proliferação ilimitada que permite gerar material suficiente para estudos bioquímicos e biológicos, (2) eles são suscetíveis a manipulações genéticas (knockdown, nocaute, superexpressão), (3) o custo é relativamente baixo, e (4) permitem um grau de simplificação biológica necessária em certas abordagens experimentais.
A IL-3 parental (interleucina-3) dependente 32G linha celular foi criada em 1983 por Greenberger e colegas por infecção de células de medula óssea de camundongos C3H/HeJ com amigo murino leucemia vírus9. Vários clones 32D foram descritos na literatura: cl-239, cl-310e cl-1011. As células de cl-3 32D foram mostradas para proliferar em IL-3 e se submeter a diferenciação neutrofílica após tratamento com estimulação de colônias de granulócitos-colônia factor (G-CSF)10. Pelo contrário, 32D cl-10 células, enquanto ser dependente de IL-3, originalmente foram não diferenciar na resposta ao tratamento de G-CSF. Em 1995, o grupo do Dr. Ivo Touw retrovirally transfectadas 32D cl-10 pilhas tipo selvagem e formas mutantes do receptor de G-CSF (G-CSF-R), a fim de identificar regiões funcionalmente importantes deste receptor11. Este estudo resultou na geração de células 32G/G-CSF-R, que são da mesma forma dependente da IL-3, mas dentro de 6 a 10 dias após a substituição da IL-3 G-CSF, células param para proliferar e diferenciar irreversivelmente em neutrófilos maduros. Estas propriedades tornam 32D cl-3 e modelos simplificados de 32G/G-CSF-R células de murino neutrofílico diferenciação que pode ser modulada por duas crescimento bem definido e fatores de diferenciação – IL-3 e G-CSF. Durante as últimas décadas vários grupos utilizaram células 32G/G-CSF-R para estudar o papel dos genes específicos em proliferação e diferenciação de células mieloides em cultura12,13,14,15 , 16e estudar o G-CSF sinalização17,18. Importante, os resultados obtidos com esta linha de celular correlacionaram com dados obtidos com as células primárias e ratos transgénicos16,19,20,21. Consequentemente, acreditamos que células de 32G/G-CSF-R, sendo um modelo amplamente utilizado e bem estabelecido, representam um valioso sistema de estudar a diferenciação mieloide, que pode ser usada em paralelo com outras abordagens para tratar esta questão.
Aqui, protocolos detalhados descrevendo a manipulação da linha celular 32G/G-CSF-R, que expansão de cobertura, diferenciação e avaliação da proliferação e diferenciação dessas células é apresentada. Informações detalhadas para modificação genética de células de 32G/G-CSF-R, quer por transdução retroviral ou particulas de Lentivirus, bem como os protocolos para a titulação do vírus são fornecidas. Além disso, vários resultados representativos que demonstram potenciais aplicações das células de 32G/G-CSF-R são fornecidos.
Protocol
Representative Results
Discussion
A escolha de um modelo experimental é uma das principais questões em investigação. Apesar de células primárias de animais e humanas são acreditadas para produzir os dados mais biologicamente relevantes, estes modelos podem envolver preocupações éticas e são frequentemente associados com procedimentos caros e/ou sofisticado isolamento/cultivo. As células primárias são limitadas em número e é dificil geneticamente manipulá-los. Além disso, as células primárias representam uma população heterogênea, c…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores Obrigado Prof Ruud Delwel e Prof Ivo Touw por nos oferecer a linha celular 32G/G-CSF-R e Prof Daniel G. Tenen por fornecer-nos com a linha de celular Bosc23. Este trabalho foi financiado por doações da Agência Grant da República Checa (GACR 15-03796S e GACR 17-02177S) a MA-J, o apoio do Instituto de Genética Molecular da Academia de Ciências a Checa (RVO 68378050) ao MA-J, uma bolsa de GA UK (projeto n. º 341015) da Universidade Charles de Praga para o MK e uma bolsa de GA UK (projeto n. º 1278217) da Universidade Charles de Praga para PD.
Materials
| RPMI 1640 powder medium | Merck, Kenilworth, NJ, USA | T 121-10 | without NaHCO3, with L-glutamine |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15028 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 31985-047 | L-Glutamine, Phenol Red |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAA Laboratories (GE Healthcare,Chicago, IL, USA) | MT35011CV | For differentiation of 32D/G-CSF-R cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270 | Used for culturing HEK293T, NIH3T3, BOSC23 cells |
| Penicillin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | P3032 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | S9137 | Streptomycin sulfate salt powder |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | G1914 | |
| murine IL-3 | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA | 213-13 | |
| human G-CSF | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA | 300-23 | |
| Polyethylenimine | Polyscience, Warrington, PA, USA | 23966 | Linear, MW 25,000 (PEI 25000) |
| Polybrene | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | H9268 | |
| Trypsin | VWR Chemicals, Radnor, PA, USA | 0458 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | E5134 | |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | C0775 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | T6146 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | D2650 | |
| May-Grünwald Giemsa | DiaPath, Martinengo, BG, Italy | 10802 |
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