マウス骨髄前駆体 32D/G-CSF-R の増殖・分化細胞
Summary
ここでマウス骨髄前駆体 32D/G-CSF-R 細胞株を培養、ウイルス感染および増殖と分化アッセイを行う目的として詳細なプロトコルが表示されます。この細胞株は、骨髄性細胞と骨髄細胞の増殖および好中球分化の興味の遺伝子の役割を勉強に適しています。
Abstract
造血幹・前駆細胞の生物学の理解では、再生医療と血液病理の治療にとって重要な意味を持ってください。生体内でモデルや初代培養を使用して得ることができる最も関連性の高いデータ、にもかかわらず造血幹・前駆細胞の低豊富はかなり彼らの調査のための適切な技術のプールを制限します。したがって、細胞の使用は、上映または大規模な細胞数を必要とする試金のパフォーマンスのための生物材料の十分な生産できます。ここで詳細な説明、読み出し、イエウサギと好中球の分化に関与するプロセスの調査のために使用されている増殖・分化アッセイの解釈を提案します。これらの実験は、IL 3 存在下で増殖し、G-CSF で区別する能力を持って 32D/G-CSF-R サイトカイン依存マウス骨髄細胞ラインを採用しています。32D/G-CSF-R セルを処理するためのプロトコルを最適化を提供し、議論する主要な落とし穴とデメリット説明アッセイと予想される結果を危険にさらす可能性があります。さらに、この資料には、レンチ ウイルスやレトロ ウイルスの生産、滴定、および 32D/-r-CSF G 細胞の情報伝達のためのプロトコルが含まれています。機能分子研究一次造血幹・前駆細胞や生体内でモデルで得られた結果を補完することができますを正常に実行するこれらの細胞の遺伝的操作を用いることができることを示す.
Introduction
造血幹・前駆細胞の人口の成熟細胞は、骨髄系 (好中球、好酸球、好塩基球、単球) から細胞を含む広い範囲から有機物を供給します。造血幹細胞の骨髄系細胞の生産を運転するプロセスはイエウサギと呼ばれ、十分な生産要求の変化への応答で成熟した骨髄系細胞がストレスと生物の適切な対処のための前提条件感染症や出血量などの条件。成熟した骨髄系細胞の分泌不足は、病原体、減らされた血凝固および他の生命にかかわる条件1,の2を除去する無力をもたらすかもしれない。さらに、骨髄系開発の変化が急性骨髄性白血病 (AML)3などの造血器腫瘍に関連付けられてあります。細胞表面の受容器4、トランスクリプション要因5の変更された式の欠陥障害シグナリング経路6形成の突然変異のように、様々 な理由によってイエウサギの変化が発生する/遺伝子7、または8腫瘍サプレッサーの遺伝子の不活化の活性化。
様々 な方法は、骨髄性の開発を研究し、このプロセスで特定の遺伝子変異の影響評価開発されています。イエウサギを研究するために使用する一般的なアプローチは、初代培養細胞およびトランスジェニック マウスを含みます。これらのモデルは、生物学的関連性の高いデータの取得を許可する、しかし彼らは特定の制限があります。一次電池の使用細胞の限られた数および遺伝子発現とその後の生物学的または生化学的な分析を変更する可能性を絞り込む、文化の制限期間が発生します。トランスジェニック マウスは高価であり、生物学的正当性の合理的な程度を必要とします。さらに、体内モデルでの作業は、特定のプロセスの興味の遺伝子の役割を理解することの複雑さの程度を追加します。したがって、これらの制限を回避するために代替的なアプローチが必要です。細胞は疑う余地のない利点を持っている: (1) 彼らは生化学的・生物学的研究のための十分な材料を生成することができます無制限の増殖能力を持っている、(2) 彼らは (ノックダウン、ノックアウト、遺伝子操作を受けやすい過剰発現)、(3) コストは比較的低く、(4) 彼らは特定の実験的アプローチに必要な生物学的簡素化の程度を許可します。
親の IL 3 (インターロイキン-3) 依存 32D セルライン グリーンバーガーおよび同僚によって、友人マウス白血病ウイルス9C3h/hej マウス骨髄細胞の感染によって 1983 年に設立されました。いくつか 32D クローンは文献で記述されていた: cl 239cl 3 の10、および cl 1011。32D cl 3 細胞は IL 3 に増殖し、顆粒球コロニー刺激因子 (G-CSF)10の治療に好中球に分化する示されていた。それどころか、もともとは G-CSF の治療に反応ながら IL 3 依存 32D の cl-10 セルを区別することがないです。1995 年に博士 Ivo Touw のグループは、この受容体11の機能的に重要な領域を識別するために野生型と G-CSF 受容体 (G CSF R) の変異形 32D の cl-10 セルを遺伝子導入。本研究により IL 3 に同様に依存している、32D/G-CSF-R のセルの生成が、細胞が増殖、成熟好中球に分化する不可逆的停止 g-csf IL 3 の交換後 6 ~ 10 日以内。これらの特性は、32D cl 3 と 32D/G-CSF-R セル 2 つの明確に定義された成長と分化因子 – IL 3 と G-CSF によって変調することができますマウスの好中球分化の簡略化モデルを作る。最後の十年の間に複数のグループは、文化12,13,14,15骨髄細胞の分化と増殖における特定の遺伝子の役割を研究するのに 32D/G-CSF-R セルを使用しています。,16、G-CSF シグナル17,18を検討します。重要なは、この細胞ラインを使用して得られた結果は、初代培養細胞およびトランスジェニック マウス16,19,20,21で得られるデータと相関。したがって、この問題に対処する他の方法と並行して使用することができます骨髄性の微分を調査する貴重なシステムを表す 32D/G-CSF-R セル、広く使用され、確立されたモデルであると考えます。
ここでは、32D/G-CSF-R セル行の処理を説明する詳細なプロトコル、どのカバー拡大、分化およびこれらの細胞の分化・増殖の評価が表示されます。32D/-r-CSF G 細胞の遺伝の変更の詳細については、ウイルスの滴定のためのプロトコルと同様に、レトロ ウイルスやレンチ ウイルスの伝達によっていずれかが提供されます。また、32D/-r-CSF G 細胞の潜在的なアプリケーションを示すいくつかの代表的な結果が提供されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
実験的なモデルの選択は、研究の主要な課題の 1 つです。主な動物やヒトの細胞は、最も生物学的に関連するデータを生成すると考えられている、これらのモデル倫理的な問題を伴うことがあります、高価なまたは洗練された養殖/分離のプロシージャに関連付けられていることが多い。一次電池の数は限られて、それらは遺伝的に操作するは難しい。さらに、一次電池はデータ解釈<sup class="…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、教授ルード ・ Delwel と 32D/G-CSF-R セルラインをご提供する教授 Ivo Touw と教授ダニエル g. Tenen Bosc23 細胞株をご提供するためにありがとうございます。この作品は MA J にチェコ共和国 (GACR 15 03796S と GACR 17 02177S) の助成機関の補助金によって支えられた、MA – j、ジョージア州英国フェローシップ (プロジェクト号 341015) チェコ科学アカデミー (RVO 68378050) の分子遺伝学研究所からのサポートPD にプラハ ・ カレル大学から MK とジョージア州英国親睦 (プロジェクト号 1278217) にプラハのチャールズ大学。
Materials
| RPMI 1640 powder medium | Merck, Kenilworth, NJ, USA | T 121-10 | without NaHCO3, with L-glutamine |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15028 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 31985-047 | L-Glutamine, Phenol Red |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAA Laboratories (GE Healthcare,Chicago, IL, USA) | MT35011CV | For differentiation of 32D/G-CSF-R cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270 | Used for culturing HEK293T, NIH3T3, BOSC23 cells |
| Penicillin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | P3032 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | S9137 | Streptomycin sulfate salt powder |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | G1914 | |
| murine IL-3 | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA | 213-13 | |
| human G-CSF | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA | 300-23 | |
| Polyethylenimine | Polyscience, Warrington, PA, USA | 23966 | Linear, MW 25,000 (PEI 25000) |
| Polybrene | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | H9268 | |
| Trypsin | VWR Chemicals, Radnor, PA, USA | 0458 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | E5134 | |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | C0775 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | T6146 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | D2650 | |
| May-Grünwald Giemsa | DiaPath, Martinengo, BG, Italy | 10802 |
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