Proliferation und Differenzierung der murinen Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Zellen
Summary
Hier werden ausführliche Protokolle für die Kultivierung der murinen myeloid Precursor-32D/G-CSF-R Zell-Linie, Durchführung Virusinfektionen und Durchführung von Proliferation und Differenzierung Assays vorgestellt. Diese Zelllinie eignet sich für das Studium myeloische Zellentwicklung und die Rolle der Gene des Interesses an myeloischer Zellwachstum und Neutrophile Differenzierung.
Abstract
Verständnis der hämatopoetischen Stammzellen und Vorläuferzellen Zelle Biologie hat wichtige Implikationen für regenerative Medizin und die Behandlung von hämatologischen Erkrankungen. Trotz der wichtigsten Daten, die Verwendung von in-Vivo -Modelle oder Primärkulturen erworben werden können, schränkt die niedrigen Fülle von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen deutlich am Pool geeigneter Techniken für ihre Untersuchung. Daher ermöglicht die Verwendung von Zelllinien ausreichende Produktion von biologischem Material für die Durchführung der Vorführungen oder Tests, die große Zelle Zahlen erfordern. Hier präsentieren wir eine detaillierte Beschreibung, Auslesen und Interpretation von Proliferation und Differenzierung Assays, die für die Untersuchung der Prozesse, die in Myelopoiesis und Neutrophile Differenzierung verwendet werden. Diese Experimente beschäftigen 32D/G-CSF-R Zytokin abhängigen murinen myeloische Zelllinie, die besitzt die Fähigkeit zu proliferieren in Anwesenheit von IL-3 und G-CSF zu unterscheiden. Wir bieten Protokolle für den Umgang mit 32D/G-CSF-R Zellen optimiert und besprechen wichtige Gefahren und Nachteile, die die beschriebenen Tests und erwarteten Ergebnisse gefährden könnte. Dieser Artikel enthält außerdem Protokolle für Lentivirale und retroviralen Produktion, Titration und Transduktion 32D/G-CSF-R-Zellen. Wir zeigen, dass genetische Manipulation dieser Zellen eingesetzt werden kann, um erfolgreich funktionelle und molekulare Studien durchzuführen, die Ergebnisse, die mit primären hämatopoetischen Stammzellen und Vorläuferzellen Zellen oder in Vivo Modellen ergänzen können.
Introduction
Die hämatopoetische Stammzellen und Vorläuferzellen Bevölkerung versorgt den Organismus mit einer Vielzahl von reifen Zellen, einschließlich der Zellen von der myeloid Abstammung (Neutrophile, eosinophile, Basophils und Monozyten). Der Prozess, der die Produktion von myeloid Zellen aus hämatopoetischen Stammzellen antreibt ist bekannt als Myelopoiesis und ausreichende Produktion von Reifen myeloische Zellen als Reaktion auf wechselnde Anforderungen ist eine Voraussetzung für den ordnungsgemäßen Umgang des Organismus mit stress Krankheiten, wie Infektionen und Blutverlust. Unzureichende Produktion von Reifen myeloische Zellen führen zu Unfähigkeit, Krankheitserreger, reduzierten Blutgerinnung und anderen lebensbedrohlichen Bedingungen1,2zu beseitigen. Darüber hinaus können Veränderungen im myeloid Abstammung Entwicklung auch hämatologischen malignen Erkrankungen, wie akute myeloische Leukämie (AML)3zugeordnet werden. Veränderungen in der Myelopoiesis können aus verschiedenen Gründen auftreten, wie z. B. Defekte Zelle Oberfläche Rezeptoren4, veränderten Ausdrucksformen der Transkription Faktoren5, Signalisierung Bahnen6, was Bildung Mutationen beeinträchtigt / Aktivierung der Onkogene7oder Inaktivierung von Tumor-Suppressor-Gene-8.
Verschiedene Methoden wurden entwickelt, um myeloischen Entwicklung zu untersuchen und beurteilen die Wirkung von bestimmten genetischen Veränderungen, die in diesem Prozess. Gemeinsame Ansätze zur Myelopoiesis Untersuchung beinhalten Primärzellen und transgenen Mäusen. Obwohl diese Modelle Erwerb von biologisch relevante Daten erlauben, haben sie bestimmte Einschränkungen. Die Verwendung von Primärzellen begegnet eine begrenzte Anzahl von Zellen und eine Sperrfrist von Kultur, Einengung der Möglichkeiten um die Genexpression und anschließende biologische oder biochemische Analyse zu ändern. Transgene Mäuse sind teuer und erfordern ein vernünftiges Maß an biologische Begründung. Darüber hinaus fügt arbeiten mit in Vivo Modellen einen Grad an Komplexität zu verstehen, die Rolle eines Gens von Interesse in einem bestimmten Prozess. Daher werden alternative Ansätze, diese Einschränkungen zu umgehen benötigt. Zell-Linien haben unbestreitbare Vorteile: (1) sie besitzen unbegrenzte Verbreitung Kapazität, die ermöglicht die Generierung von genug Material für biochemische und biologische Studien, (2) sie sind anfällig für genetische Manipulationen (Zuschlag, Ko, Überexpression), (3) die Kosten sind relativ gering, und (4) sie erlauben eine gewisse biologische Vereinfachung in bestimmten experimentellen Ansätze erforderlich.
Die elterliche IL-3 (Interleukin-3) abhängige 32D Zelllinie wurde 1983 von Greenberger und Kollegen durch Infektion der Knochenmarkzellen von C3H/HeJ Mäuse mit Freund murine Leukämie-Virus9gegründet. Mehreren 32D Klone wurden in der Literatur beschrieben: cl-239, cl-310und cl-10-11. Die 32D cl-3 Zellen erwiesen sich vermehren sich in IL-3 und Neutrophile Differenzierung bei der Behandlung mit Granulozyten-Kolonie Stimulation Faktor (G-CSF)10zu unterziehen. Im Gegenteil, waren 32D cl-10 Zellen, während IL-3 abhängige Wesen ursprünglich nicht in Reaktion auf die Behandlung von G-CSF Differenzierung. Im Jahr 1995 ausgestrahlt der Gruppe von Dr. Ivo Touw retrovirally 32D cl-10 Zellen mit Wildtyp und mutierte Formen von G-CSF Rezeptor (G-CSF-R), um funktionell wichtige Regionen dieses Rezeptors11zu ermitteln. Diese Studie ergab Generation von den 32D/G-CSF-R-Zellen, die in ähnlicher Weise abhängig von IL-3 sind, aber innerhalb von 6 bis 10 Tage nach dem Austausch des IL-3 mit G-CSF, Zellen aufhören zu vermehren und irreversibel in Reife Neutrophile unterscheiden. Diese Eigenschaften machen 32D cl-3 und 32D/G-CSF-R Zellen vereinfachte Modelle der murinen Neutrophile Differenzierung, die durch zwei klar definierte Wachstums- und Differenzierungsfaktoren – IL-3 und G-CSF moduliert werden kann. In den letzten Jahrzehnten haben mehrere Gruppen 32D/G-CSF-R-Zellen verwendet, um die Rolle bestimmter Gene Proliferation und Differenzierung myeloischer Zellen in Kultur12,13,14,15 studieren , 16, und G-CSF Signalisierung17,18zu studieren. Wichtig ist, die erzielten Ergebnisse mit dieser Zelllinie mit Primärzellen mit transgenen Mäusen16,19,20,21gewonnenen Daten korreliert. Daher glauben wir, dass 32D/G-CSF-R-Zellen, eine verbreitete und etablierte Modell, stellen ein wertvolles System myeloische Differenzierung zu studieren, die parallel mit anderen Ansätzen dieser Frage verwendet werden können.
Hier ausführliche Protokolle, die Handhabung der Zelllinie 32D/G-CSF-R beschreiben, welche Abdeckung Erweiterung, Differenzierung und Bewertung der Proliferation und Differenzierung der Zellen wird vorgestellt. Detaillierte Informationen für die genetische Veränderung von 32D/G-CSF-R-Zellen sind entweder durch Retroviren oder Lentivirale Transduktion sowie Protokolle für die Virus-Titration zur Verfügung gestellt. Darüber hinaus sind mehrere repräsentative Ergebnisse, die Anwendungsmöglichkeiten der 32D/G-CSF-R Zellen zeigen zur Verfügung gestellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Wahl von einem experimentellen Modell ist eines der wichtigsten Themen in der Forschung. Obwohl primäre tierische und menschliche Zellen geglaubt werden, um die biologisch relevanten Daten zu produzieren, diese Modelle können beinhalten ethische Bedenken und sind oft teuer und/oder anspruchsvolle Isolierung/Kultivierung Verfahren zugeordnet. Primäre Zellen sind in Stückzahlen begrenzt und es ist schwer sie genetisch zu manipulieren. Darüber hinaus stellen primäre Zellen eine heterogene Bevölkerung setzt sich a…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Prof. Ruud Delwel und Prof. Ivo Touw für die uns mit der 32D/G-CSF-R Zell-Linie und Prof. Daniel G. Tenen für die uns mit der Bosc23-Zell-Linie. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse der Grant-Agentur der Tschechischen Republik (GACR 15-03796S und GACR 17-02177S), MA-J, unterstützt vom Institut für Molekulargenetik der Tschechischen Akademie der Wissenschaften (RVO 68378050), MA-J, ein GA-UK-Stipendium (Projekt Nr. 341015) Charles Universität in Prag zu MK und ein GA-UK-Stipendium (Projekt Nr. 1278217) von Charles Universität in Prag, PD.
Materials
| RPMI 1640 powder medium | Merck, Kenilworth, NJ, USA | T 121-10 | without NaHCO3, with L-glutamine |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15028 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 31985-047 | L-Glutamine, Phenol Red |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAA Laboratories (GE Healthcare,Chicago, IL, USA) | MT35011CV | For differentiation of 32D/G-CSF-R cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270 | Used for culturing HEK293T, NIH3T3, BOSC23 cells |
| Penicillin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | P3032 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | S9137 | Streptomycin sulfate salt powder |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | G1914 | |
| murine IL-3 | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA | 213-13 | |
| human G-CSF | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA | 300-23 | |
| Polyethylenimine | Polyscience, Warrington, PA, USA | 23966 | Linear, MW 25,000 (PEI 25000) |
| Polybrene | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | H9268 | |
| Trypsin | VWR Chemicals, Radnor, PA, USA | 0458 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | E5134 | |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | C0775 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | T6146 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | D2650 | |
| May-Grünwald Giemsa | DiaPath, Martinengo, BG, Italy | 10802 |
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