Пролиферации и дифференцировки Murine миелоидного прекурсоров 32D/G-CSF-r клетки
Summary
Здесь представлены подробные протоколы для культивирования 32D/G-CSF-R клеточная линия murine миелоидного прекурсоров, вирусных инфекций и проведение анализов пролиферации и дифференцировки. Эта линия клетки подходит для изучения развития миелоидных клеток и роль генов интерес к росту миелоидных клеток и нейтрофильных дифференциации.
Abstract
Понимание гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток биологии имеет важные последствия для регенеративной медицины и лечения гематологических патологий. Несмотря на наиболее актуальные данные, которые могут быть приобретены с использованием модели в естественных условиях или первичных культур низкая обилие гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток значительно ограничивает круг подходящих методов для их расследования. Таким образом использование клеточных линий позволяет достаточно производства биологического материала для выполнения показы или анализов, которые требуют числа крупных клеток. Здесь мы представляем, подробное описание, индикация и интерпретации пролиферации и дифференцировки анализов, которые используются для исследования процессов в myelopoiesis и нейтрофильных дифференциации. Эти эксперименты используют 32D G-CSF-реляционный cytokine зависимых murine миелоидного клеток линии, которая обладает способностью размножаться в присутствии Ил-3 и дифференцировать в G-CSF. Мы предлагаем оптимизированный протоколы для обработки клеток 32D/G-CSF-R и обсудить основные недостатки и недостатки, которые могли бы скомпрометировать описанных анализов и ожидаемые результаты. Кроме того эта статья содержит протоколы для производства лентивирусные и антиретровирусного лечения, титрование и трансдукция 32D/G-CSF-R клеток. Мы демонстрируем, что генетические манипуляции этих клеток могут быть использованы для успешного выполнения функциональных и молекулярные исследования, которые могут дополнять результаты, полученные с основной гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток или модели в естественных условиях .
Introduction
Гемопоэтических стволовых и прогениторных населения поставляет в организм с большим диапазоном зрелых клеток, включая клетки миелоидного lineage (нейтрофилов, эозинофилов, базофилов и моноцитов). Процесс, который управляет производства миелоидных клеток от гемопоэтических стволовых клеток известен как myelopoiesis, и надлежащего производства зрелой миелоидных клеток в ответ на меняющиеся требования является необходимым условием для надлежащего решения проблем организма с стресса условия, такие как инфекции и потери крови. Недостаточное производство зрелых миелоидных клеток может привести к неспособности устранить патогенов, свертываемость крови, снижение и других угрожающих жизни условиях1,2. Кроме того изменения в развитии миелоидного линии также могут быть связаны с гемобластозами, например, острый миелоидный лейкоз (ОМЛ)3. Изменения в myelopoiesis может произойти из-за различных причин, таких, как дефекты в ячейке поверхности рецепторы4изменены выражения факторов транскрипции5, нарушениями сигнальные пути6, мутации, что приводит к формированию / Активация онкогенов7или инактивации генов усмирителя тумора8.
Различные методы были разработаны для изучения миелоидного развития и оценить воздействие конкретных генетических изменений в этот процесс. Общие подходы, используемые для изучения myelopoiesis связаны главные ячейки и трансгенных мышей. Хотя эти модели позволяют приобретение биологически соответствующих данных, они имеют определенные ограничения. Использование начальной клеток встречает ограниченное количество клеток и ограниченного периода культуры, сужение возможностей для изменения экспрессии генов и последующие биологические или биохимический анализ. Трансгенных мышей являются дорогостоящими и требуют разумную степень биологического обоснования. Кроме того работа с моделями в vivo добавляет степень сложности в понимании роли ген интереса в данном процессе. Таким образом необходимы альтернативные подходы, чтобы обойти эти ограничения. Линии клетки имеют неоспоримые преимущества: (1) они обладают потенциалом неограниченное распространение, что позволяет генерировать достаточно материала для биохимических и биологических исследований, (2) они чувствительны к генетической манипуляции (нокдаун, нокаут, Гиперэкспрессия), (3) стоимость сравнительно низка, и (4) они позволяют степень биологического упрощение в некоторых экспериментальных подходов.
Родительский Ил-3 (интерлейкинов-3) зависимых 32D клеточная линия была учреждена в 1983 году Greenberger и его коллеги инфекции клеток костного мозга от мышей C3H/HeJ друг мышиных лейкемии Вирус9. Несколько 19 d клоны были описаны в литературе: cl-239, cl-310и11cl-10. 36 d cl-3 клетки были продемонстрированы размножаться в ил-3 и пройти нейтрофильных дифференциация по обращению с гранулоцитов колонии стимуляции фактор (Г-КСФ)10. Напротив 27 d cl-10 клеток, будучи зависимой Ил-3, первоначально не были дифференциации в ответ на лечение Г-КСФ. В 1995 году группа д-р Иво Touw retrovirally преобразованы 30 d cl-10 клеток с дикого типа и мутантов формы рецептора Г-КСФ (G-CSF-R), с тем чтобы определить функционально важных регионах этот рецептор11. Это исследование привело к генерации клеток 32D/G-CSF-R, которые аналогичным образом зависят Ил-3, но в пределах 6-10 дней после замены Ил-3 с G-CSF, клетки перестают размножаться и необратимо дифференцироваться в Зрелые нейтрофилы. Эти свойства делают 30 d cl-3 и упрощенные модели клетки 32D/G-CSF-R мышиных нейтрофильных дифференциации, которая может быть модулированные два четко определенных роста и дифференциации факторов – Ил-3 и G-CSF. В течение последних десятилетий несколько групп использовали 32D/G-CSF-R клетки для изучения роли конкретных генов в распространение и дифференцировку миелоидных клеток в культуре12,13,14,15 , 16и для изучения Г-КСФ, сигнализируя17,18. Важно отметить, что результаты, полученные с помощью этой линии клетки коррелирует с данных, полученных с первичные элементы и трансгенных мышей16,19,,2021. Следовательно мы считаем, что 32D/G-CSF-R клетки, будучи широко используется и устоявшиеся модели, представляют собой ценный системы для изучения миелоидного дифференциация, которая может использоваться параллельно с другими подходами, рассмотреть этот вопрос.
Здесь является представил подробные протоколы, описывающие обработку 32D/G-CSF-R клеточной линии, которой расширения покрытия, дифференциация и оценки распространения и дифференциации этих клеток. Подробная информация для генетической модификации 32D/G-CSF-R клеток, либо ретровирусных или лентивирусные трансдукции, а также протоколы для титрования вирус предоставляются. Кроме того предоставляются несколько представительных результаты, которые демонстрируют возможности применения клеток 32D/G-CSF-R.
Protocol
Representative Results
Discussion
Выбор экспериментальной модели является одним из основных вопросов в области научных исследований. Хотя считается, что основной клетки животных и человека производят наиболее биологически соответствующих данных, эти модели может включать этические проблемы и часто связаны с дорогим…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят профессор Рууд Delwel и профессор Иво Touw за предоставленную нам с линией клеток 32D/G-CSF-R и профессор Даниэль G. Tenen за предоставление нам с линией клеток Bosc23. Эта работа была поддержана грантов грант агентства Чешской Республики (GACR 15-03796S и GACR 17-02177S) для ма-J, поддержки от Института молекулярной генетики Чешской академии наук (РВО 68378050) ма-j, Стипендия Великобритании GA (проект № 341015) от Карлова университета в Праге МК, и Стипендия Великобритании GA (проект № 1278217) от Карлова университета в Праге, PD.
Materials
| RPMI 1640 powder medium | Merck, Kenilworth, NJ, USA | T 121-10 | without NaHCO3, with L-glutamine |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15028 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 31985-047 | L-Glutamine, Phenol Red |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAA Laboratories (GE Healthcare,Chicago, IL, USA) | MT35011CV | For differentiation of 32D/G-CSF-R cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270 | Used for culturing HEK293T, NIH3T3, BOSC23 cells |
| Penicillin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | P3032 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | S9137 | Streptomycin sulfate salt powder |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | G1914 | |
| murine IL-3 | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA | 213-13 | |
| human G-CSF | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA | 300-23 | |
| Polyethylenimine | Polyscience, Warrington, PA, USA | 23966 | Linear, MW 25,000 (PEI 25000) |
| Polybrene | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | H9268 | |
| Trypsin | VWR Chemicals, Radnor, PA, USA | 0458 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | E5134 | |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | C0775 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | T6146 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | D2650 | |
| May-Grünwald Giemsa | DiaPath, Martinengo, BG, Italy | 10802 |
Referencias
- Bonilla, M. A., et al. Effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor on neutropenia in patients with congenital agranulocytosis. N Engl J Med. 320 (24), 1574-1580 (1989).
- Bennett, C. L., Djulbegovic, B., Norris, L. B., Armitage, J. O. Colony-stimulating factors for febrile neutropenia during cancer therapy. N Engl J Med. 368 (12), 1131-1139 (2013).
- Lowenberg, B., Downing, J. R., Burnett, A. Acute myeloid leukemia. N Engl J Med. 341 (14), 1051-1062 (1999).
- Dong, F., et al. Identification of a nonsense mutation in the granulocyte-colony-stimulating factor receptor in severe congenital neutropenia. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (10), 4480-4484 (1994).
- Rosenbauer, F., Tenen, D. G. Transcription factors in myeloid development: balancing differentiation with transformation. Nat Rev Immunol. 7 (2), 105-117 (2007).
- Kota, J., Caceres, N., Constantinescu, S. N. Aberrant signal transduction pathways in myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 22 (10), 1828-1840 (2008).
- Kvinlaug, B. T., et al. Common and overlapping oncogenic pathways contribute to the evolution of acute myeloid leukemias. Cancer Res. 71 (12), 4117-4129 (2011).
- Krug, U., Ganser, A., Koeffler, H. P. Tumor suppressor genes in normal and malignant hematopoiesis. Oncogene. 21 (21), 3475-3495 (2002).
- Greenberger, J. S., Sakakeeny, M. A., Humphries, R. K., Eaves, C. J., Eckner, R. J. Demonstration of permanent factor-dependent multipotential (erythroid/neutrophil/basophil) hematopoietic progenitor cell lines. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (10), 2931-2935 (1983).
- Valtieri, M., et al. Cytokine-dependent granulocytic differentiation. Regulation of proliferative and differentiative responses in a murine progenitor cell line. J Immunol. 138 (11), 3829-3835 (1987).
- Dong, F., et al. Mutations in the gene for the granulocyte colony-stimulating-factor receptor in patients with acute myeloid leukemia preceded by severe congenital neutropenia. N Engl J Med. 333 (8), 487-493 (1995).
- Jorda, M. A., Lowenberg, B., Delwel, R. The peripheral cannabinoid receptor Cb2, a novel oncoprotein, induces a reversible block in neutrophilic differentiation. Blood. 101 (4), 1336-1343 (2003).
- Jorda, M. A., et al. Hematopoietic cells expressing the peripheral cannabinoid receptor migrate in response to the endocannabinoid 2-arachidonoylglycerol. Blood. 99 (8), 2786-2793 (2002).
- Abbas, S., et al. Integrated genome-wide genotyping and gene expression profiling reveals BCL11B as a putative oncogene in acute myeloid leukemia with 14q32 aberrations. Haematologica. 99 (5), 848-857 (2014).
- Zhuang, D., Qiu, Y., Kogan, S. C., Dong, F. Increased CCAAT enhancer-binding protein epsilon (C/EBPepsilon) expression and premature apoptosis in myeloid cells expressing Gfi-1 N382S mutant associated with severe congenital neutropenia. J Biol Chem. 281 (16), 10745-10751 (2006).
- Zjablovskaja, P., et al. EVI2B is a C/EBPalpha target gene required for granulocytic differentiation and functionality of hematopoietic progenitors. Cell Death Differ. 24 (4), 705-716 (2017).
- Santini, V., et al. The carboxy-terminal region of the granulocyte colony-stimulating factor receptor transduces a phagocytic signal. Blood. 101 (11), 4615-4622 (2003).
- Liu, H., Qiu, Y., Xiao, L., Dong, F. Involvement of protein kinase Cepsilon in the negative regulation of Akt activation stimulated by granulocyte colony-stimulating factor. J Immunol. 176 (4), 2407-2413 (2006).
- Kelly, L. M., et al. FLT3 internal tandem duplication mutations associated with human acute myeloid leukemias induce myeloproliferative disease in a murine bone marrow transplant model. Blood. 99 (1), 310-318 (2002).
- Pikman, Y., et al. MPLW515L is a novel somatic activating mutation in myelofibrosis with myeloid metaplasia. PLoS Med. 3 (7), e270 (2006).
- Schwaller, J., et al. Transformation of hematopoietic cell lines to growth-factor independence and induction of a fatal myelo- and lymphoproliferative disease in mice by retrovirally transduced TEL/JAK2 fusion genes. EMBO J. 17 (18), 5321-5333 (1998).
- Drobek, A., et al. PSTPIP2, a Protein Associated with Autoinflammatory Disease, Interacts with Inhibitory Enzymes SHIP1 and Csk. J Immunol. 195 (7), 3416-3426 (2015).
- Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. J Virol. 70 (8), 5701-5705 (1996).
- Alberich-Jorda, M., et al. C/EBPgamma deregulation results in differentiation arrest in acute myeloid leukemia. J Clin Invest. 122 (12), 4490-4504 (2012).
- Calabretta, B., Perrotti, D. The biology of CML blast crisis. Blood. 103 (11), 4010-4022 (2004).
- Ren, R. Mechanisms of BCR-ABL in the pathogenesis of chronic myelogenous leukaemia. Nat Rev Cancer. 5 (3), 172-183 (2005).
- Schuster, C., et al. The effects of Bcr-Abl on C/EBP transcription-factor regulation and neutrophilic differentiation are reversed by the Abl kinase inhibitor imatinib mesylate. Blood. 101 (2), 655-663 (2003).
- Chang, J. S., et al. High levels of the BCR/ABL oncoprotein are required for the MAPK-hnRNP-E2 dependent suppression of C/EBPalpha-driven myeloid differentiation. Blood. 110 (3), 994-1003 (2007).
- Velten, L., et al. Human haematopoietic stem cell lineage commitment is a continuous process. Nat Cell Biol. 19 (4), 271-281 (2017).
- Jorda, M. A., Rayman, N., Valk, P., De Wee, E., Delwel, R. Identification, characterization, and function of a novel oncogene: the peripheral cannabinoid receptor Cb2. Ann N Y Acad Sci. 996, 10-16 (2003).
- Wurm, A. A., et al. Disruption of the C/EBPalpha-miR-182 balance impairs granulocytic differentiation. Nat Commun. 8 (1), 46 (2017).
- Agliano, A. M., et al. On chromosomal instability: what is the karyotype of your 32D CI3 cell line. Blood. 95 (11), 3636-3637 (2000).
- Wang, G. G., et al. Quantitative production of macrophages or neutrophils ex vivo using conditional Hoxb8. Nat Methods. 3 (4), 287-293 (2006).
- Houston, I. B., Huang, K. J., Jennings, S. R., DeKoter, R. P. PU.1 immortalizes hematopoietic progenitors in a GM-CSF-dependent manner. Exp Hematol. 35 (3), 374-384 (2007).
- Calvo, K. R., Sykes, D. B., Pasillas, M., Kamps, M. P. Hoxa9 immortalizes a granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-dependent promyelocyte capable of biphenotypic differentiation to neutrophils or macrophages, independent of enforced meis expression. Mol Cell Biol. 20 (9), 3274-3285 (2000).
- Calvo, K. R., Sykes, D. B., Pasillas, M. P., Kamps, M. P. Nup98-HoxA9 immortalizes myeloid progenitors, enforces expression of Hoxa9, Hoxa7 and Meis1, and alters cytokine-specific responses in a manner similar to that induced by retroviral co-expression of Hoxa9 and Meis1. Oncogene. 21 (27), 4247-4256 (2002).
- Fossati-Jimack, L., et al. Phagocytosis is the main CR3-mediated function affected by the lupus-associated variant of CD11b in human myeloid cells. PLoS One. 8 (2), e57082 (2013).
- Schwable, J., et al. RGS2 is an important target gene of Flt3-ITD mutations in AML and functions in myeloid differentiation and leukemic transformation. Blood. 105 (5), 2107-2114 (2005).
- Worch, J., et al. The serine-threonine kinase MNK1 is post-translationally stabilized by PML-RARalpha and regulates differentiation of hematopoietic cells. Oncogene. 23 (57), 9162-9172 (2004).
- Rowley, J. D. Letter: A new consistent chromosomal abnormality in chronic myelogenous leukaemia identified by quinacrine fluorescence and Giemsa staining. Nature. 243 (5405), 290-293 (1973).
- Stam, K., et al. Evidence of a new chimeric bcr/c-abl mRNA in patients with chronic myelocytic leukemia and the Philadelphia chromosome. N Engl J Med. 313 (23), 1429-1433 (1985).
- Holly, S. P., Larson, M. K., Parise, L. V. The unique N-terminus of R-ras is required for Rac activation and precise regulation of cell migration. Mol Biol Cell. 16 (5), 2458-2469 (2005).
- Pierce, J. H., et al. Macrophage-colony-stimulating factor (CSF-1) induces proliferation, chemotaxis, and reversible monocytic differentiation in myeloid progenitor cells transfected with the human c-fms/CSF-1 receptor cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (15), 5613-5617 (1990).
- Pierce, J. H., et al. Signal transduction through the EGF receptor transfected in IL-3-dependent hematopoietic cells. Science. 239 (4840), 628-631 (1988).
- Oomen, S. P., et al. Somatostatin modulates G-CSF-induced but not interleukin-3-induced proliferative responses in myeloid 32D cells via activation of somatostatin receptor subtype 2. Hematol J. 2 (5), 322-329 (2001).
- Oomen, S. P., et al. Somatostatin is a selective chemoattractant for primitive (CD34(+)) hematopoietic progenitor cells. Exp Hematol. 30 (2), 116-125 (2002).
- Nogami, A., et al. FLT3-ITD confers resistance to the PI3K/Akt pathway inhibitors by protecting the mTOR/4EBP1/Mcl-1 pathway through STAT5 activation in acute myeloid leukemia. Oncotarget. 6 (11), 9189-9205 (2015).
- Rodel, J. E., Link, D. C. Suppression of apoptosis during cytokine deprivation of 32D cells is not sufficient to induce complete granulocytic differentiation. Blood. 87 (3), 858-864 (1996).
- Daley, G. Q., Baltimore, D. Transformation of an interleukin 3-dependent hematopoietic cell line by the chronic myelogenous leukemia-specific P210bcr/abl protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (23), 9312-9316 (1988).
