JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biología del desarrollo

انتشار وتمايز السلائف النقوي موريني 32D/ز-CSF-R الخلايا

Published: February 21, 2018
doi:
10.3791/57033
, , ,
1Department of Hemato-Oncology,Institute of Molecular Genetics of the ASCR, 2Childhood Leukaemia Investigation Prague, Department of Paediatric Haematology and Oncology, 2nd Faculty of Medicine,Charles University

Summary

وترد هنا بروتوكولات مفصلة لاستزراع خط الخلية 32D/ز-CSF آر السلائف النقوي مورين وأداء العدوى الفيروسية، والقيام بفحوصات الانتشار والتفرقة. هذا الخط خلية مناسبة لدراسة التنمية الخلية النقوي، ودور جينات فائدة في نمو الخلايا النقوي والتمايز بيضاء.

Abstract

فهم بيولوجيا الخلايا الجذعية والسلف المكونة للدم على آثار هامة للطب التجديدي، وعلاج أمراض الدم. على الرغم من البيانات الأكثر أهمية التي يمكن الحصول عليها باستخدام النماذج في فيفو أو الثقافات الأولية، يقيد وفرة منخفضة للخلايا الجذعية والسلف المكونة للدم إلى حد كبير مجموعة تقنيات مناسبة للتحقيق فيها. ولذلك، يسمح استخدام خطوط الخلايا يكفي إنتاج المواد البيولوجية لأداء عروض أو الاختبارات التي تتطلب إعداد كبيرة من الخلايا. وهنا يقدم وصفاً مفصلاً، وقراءات، وتفسير لفحوصات الانتشار والتفرقة التي تستخدم لتحقيق العمليات التي ينطوي عليها ميلوبويسيس والتمايز بالعدلات. وتستخدم هذه التجارب خط الخلية النقوي مورين التابعة سيتوكين 32D/ز-CSF آر، التي تمتلك القدرة على تكاثر حضور إيل-3 والتفريق في ز-CSF. نحن نقدم الأمثل بروتوكولات للتعامل مع الخلايا 32D/ز-CSF آر ومناقشة المزالق الرئيسية والسلبيات التي قد تضر بوصف فحوصات والنتائج المتوقعة. بالإضافة إلى ذلك، تحتوي هذه المقالة على بروتوكولات لإنتاج لينتيفيرال والفيروسات التراجعية، والمعايرة، وتوصيل الخلايا 32D/ز-CSF-R. علينا أن نظهر أن التلاعب الوراثي لهذه الخلايا يمكن أن تستخدم لإجراء الدراسات الفنية والجزيئية، التي يمكن أن تكمل النتائج التي تم الحصول عليها مع الأولية المكونة للدم الخلايا الجذعية والسلف أو نماذج في فيفو بنجاح.

Introduction

إمدادات السكان المكونة للدم الجذعية والسلف الكائن مع مجموعة كبيرة من الخلايا الناضجة، بما في ذلك الخلايا من نسب النقوي (العَدلات، الحمضات، الاسسه، ووحيدات). العملية التي تقود إنتاج خلايا النقوي من الخلايا الجذعية المكونة للدم يعرف باسم ميلوبويسيس، ويكفي إنتاج خلايا النقوي ناضجة في الاستجابة للمتطلبات المتغيرة شرط مسبق للتعامل السليم في الحي مع الإجهاد الشروط، مثل الالتهابات وفقدان الدم. قد يؤدي عدم كفاية إنتاج خلايا النقوي ناضجة للتمكن من القضاء على مسببات الأمراض وتخثر الدم المخفضة، وأخرى تهدد الحياة ظروف1،2. وبالإضافة إلى ذلك، تعديلات في نسب النقوي التنمية قد يكون مرتبطاً أيضا بالأورام الخبيثة الدموية، مثل سرطان الدم النقوي الحاد (AML)3. قد تحدث تغييرات في ميلوبويسيس لأسباب مختلفة، مثل عيوب في خلايا المستقبلات السطحية4، تعبيرات غيرت من عوامل النسخ5، ضعف مسارات الإشارات6، الطفرات أسفر عن تشكيل/ تفعيل المسرطنة7، أو المنظمة من ورم المكثف الجينات8.

وقد وضعت أساليب مختلفة لدراسة التنمية النقوي، وتقييم أثر التعديلات الوراثية المحددة في هذه العملية. ينطوي النهج المشتركة المستخدمة لدراسة ميلوبويسيس الخلايا الأولية والفئران المعدلة وراثيا. على الرغم من أن هذه النماذج تسمح الحصول على البيانات ذات الصلة بيولوجيا، لديهم بعض القيود. واجه استخدام الخلايا الأولية على عدد محدود من الخلايا وفترة مقيدة للثقافة، وتضييق إمكانيات لتغيير التعبير الجيني وتحليل البيولوجية أو الكيميائية الحيوية اللاحقة. الفئران المعدلة وراثيا هي مكلفة وتتطلب درجة معقولة من التبرير البيولوجي. وبالإضافة إلى ذلك، يضيف العامل مع نماذج في فيفو على درجة من التعقيد في فهم دور الجينات للاهتمام بعملية معينة. ولذلك، يلزم نهج بديلة للتحايل على هذه القيود. خطوط الخلية لها مزايا لا جدال فيه: (1) أنها تمتلك قدرة الانتشار غير المحدود الذي يسمح لتوليد ما يكفي من المواد للدراسات البيوكيميائية والبيولوجية، (2) فعرضه للتلاعب الوراثي (ضربة قاضية، خروج المغلوب، overexpression)، (3) التكلفة منخفضة نسبيا، و (4) أنها تسمح بقدر من التبسيط البيولوجية المطلوبة في بعض النهج التجريبي.

3 إيل الأبوية (انترلوكين-3) 32D تعتمد خط الخلية أنشئت في عام 1983 جرينبيرجير وزملاؤه بعدوى خلايا نخاع العظام من الفئران C3H/HeJ مع صديق اللوكيميا مورين الفيروسات9. ووصفت استنساخ 32D عدة في الأدب: cl-239و cl-310و cl-1011. وعرضت 32D cl-3 الخلايا تتكاثر في إيل-3 والخضوع للتمايز بيضاء على المعاملة مع مستعمرة المحببات التحفيز عامل (ز-CSF)10. على العكس من ذلك، 32D cl-10 خلايا، حين أنها تعتمد على 3 إيل، أصلاً كانت لا التفريق في الاستجابة للعلاج ز-CSF. وفي عام 1995 ترانسدوسيد مجموعة الدكتور إيفو تو ريتروفيرالي 32D cl-10 خلايا مع نوع البرية وأشكال المسخ من مستقبلات ز-CSF (ز-CSF آر)، بغية تحديد المناطق الهامة وظيفيا لهذا مستقبلات11. وأسفرت هذه الدراسة جيل الخلايا 32D/ز-CSF آر، التي تعتمد على نحو مماثل في إيل-3، ولكن في غضون 6 إلى 10 يوما بعد استبدال إيل-3 مع ز-CSF، تتوقف الخلايا تتكاثر وتفرق بلا رجعة في العَدلات الناضجة. هذه الخصائص تجعل 32D cl-3 والخلايا 32D/ز-CSF آر نماذج مبسطة من التمايز بالعدلات مورين التي يمكن أن تكون عن طريق اثنين من نمو محددة تحديداً جيدا وعوامل التمايز-إيل-3 وز-CSF التضمين. خلال العقود الماضية قد استخدمت مجموعات متعددة الخلايا 32D/ز-CSF آر لدراسة دور الجينات خاصة في الانتشار وتمايز الخلايا النقوي في الثقافة12،13،،من1415 , 16، ودراسة ز-CSF مما يشير إلى17،18. الأهم من ذلك، النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام هذا الخط خلية ترتبط مع البيانات التي تم الحصول عليها مع الخلايا الأولية والفئران المعدلة وراثيا16،19،،من2021. ونتيجة لذلك، نعتقد أن الخلايا 32D/ز-CSF آر، يجري نموذج الراسخة والمستخدمة على نطاق واسع، تمثل نظاما قيماً لدراسة النقوي التمايز التي يمكن استخدامها بالتوازي مع نهج أخرى التصدي لهذه المسألة.

هنا، يرد بروتوكولات مفصلة تصف التعامل مع خط الخلية 32D/ز-CSF آر، التي توسع الغطاء والتمايز وتقييم الانتشار والتفريق بين هذه الخلايا. للتعديل الوراثي للخلايا 32D/ز-CSF آر، أما عن طريق توصيل النسخ العكسي أو لينتيفيرال، فضلا عن البروتوكولات لمعايرة الفيروس هي معلومات تفصيلية. وبالإضافة إلى ذلك، يتم توفير العديد من النتائج التمثيلية التي تثبت التطبيقات المحتملة للخلايا 32D/ز-CSF آر.

Protocol

ملاحظة: الخطوات تصف التوسع، التمايز، وتوصيل الخلايا 32D/ز-CSF آر ترد أدناه. 1-إعداد إعداد الوسائط تحضير 250 مل من الثقافة المتوسطة: المتوسطة 1640 RPMI (معهد ميموريال بارك روزويل) تستكمل مع الحرارة 10% إبطال FBS (الجنين المصل البقري)، وايل-3 مورين (10 نانوغرام/مل). وب?…

Representative Results

انتشار وتمايز الخلايا 32D/ز-CSF-R لتقييم انتشار الخلايا 32D/ز-CSF آر تحت ظروف برو التكاثري والمؤيدة التمايز، كان مثقف خلايا 32D/ز-CSF-R في الوسائط التي تحتوي على 3 إيل وز-CSF، على التوالي. ولوحظ أن انقسام الخلايا المستزرعة في إيل-3 التي تحتوي على المتوسط (…

Discussion

اختيار نموذج تجريبي إحدى القضايا الرئيسية في مجال البحوث. على الرغم من أن يعتقد أن الخلايا الحيوانية والبشرية الأساسية لإنتاج البيانات ذات الصلة الأكثر بيولوجيا، هذه النماذج قد تشمل الشواغل الأخلاقية وغالباً ما تكون مقترنة بإجراءات مكلفة و/أو المتطورة العزلة/استزراع. الخلايا الأولية مح…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

يشكر المؤلفون البروفيسور رود دلول والبروفيسور إيفو تو لتزويدنا بخط الخلية 32D/ز-CSF آر، والبروفيسور دانيال زاي تينين على تزويدنا بخط الخلية Bosc23. أيد منح الوكالة منحة للجمهورية التشيكية (جاكر 15-03796S وجاكر 17-02177S) لما ي هذا العمل، ودعم من معهد علم الوراثة الجزيئي “أكاديمية العلوم التشيكية” (رفو 68378050) MA-ي، زمالة المملكة المتحدة GA (المشروع رقم 341015) من جامعة تشارلز في براغ لعضو الكنيست، وزمالة المملكة المتحدة GA (المشروع رقم 1278217) من جامعة تشارلز في براغ للمشتريات.

Materials

RPMI 1640 powder medium Merck, Kenilworth, NJ, USA T 121-10 without NaHCO3, with L-glutamine
DMEM Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 15028
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 31985-047 L-Glutamine, Phenol Red
Fetal bovine serum (FBS) PAA Laboratories (GE Healthcare,Chicago, IL, USA) MT35011CV For differentiation of 32D/G-CSF-R cells
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 10270 Used for culturing HEK293T, NIH3T3, BOSC23 cells
Penicillin Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) P3032
Streptomycin Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) S9137 Streptomycin sulfate salt powder
Gentamicin Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) G1914
murine IL-3 PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA 213-13
human G-CSF PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA 300-23
Polyethylenimine Polyscience, Warrington, PA, USA 23966 Linear, MW 25,000 (PEI 25000)
Polybrene Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) H9268
Trypsin VWR Chemicals, Radnor, PA, USA 0458
EDTA Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) E5134
Crystal violet Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) C0775
Trypan blue Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) T6146
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) D2650
May-Grünwald Giemsa DiaPath, Martinengo, BG, Italy 10802
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Bonilla, M. A., et al. Effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor on neutropenia in patients with congenital agranulocytosis. N Engl J Med. 320 (24), 1574-1580 (1989).
  2. Bennett, C. L., Djulbegovic, B., Norris, L. B., Armitage, J. O. Colony-stimulating factors for febrile neutropenia during cancer therapy. N Engl J Med. 368 (12), 1131-1139 (2013).
  3. Lowenberg, B., Downing, J. R., Burnett, A. Acute myeloid leukemia. N Engl J Med. 341 (14), 1051-1062 (1999).
  4. Dong, F., et al. Identification of a nonsense mutation in the granulocyte-colony-stimulating factor receptor in severe congenital neutropenia. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (10), 4480-4484 (1994).
  5. Rosenbauer, F., Tenen, D. G. Transcription factors in myeloid development: balancing differentiation with transformation. Nat Rev Immunol. 7 (2), 105-117 (2007).
  6. Kota, J., Caceres, N., Constantinescu, S. N. Aberrant signal transduction pathways in myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 22 (10), 1828-1840 (2008).
  7. Kvinlaug, B. T., et al. Common and overlapping oncogenic pathways contribute to the evolution of acute myeloid leukemias. Cancer Res. 71 (12), 4117-4129 (2011).
  8. Krug, U., Ganser, A., Koeffler, H. P. Tumor suppressor genes in normal and malignant hematopoiesis. Oncogene. 21 (21), 3475-3495 (2002).
  9. Greenberger, J. S., Sakakeeny, M. A., Humphries, R. K., Eaves, C. J., Eckner, R. J. Demonstration of permanent factor-dependent multipotential (erythroid/neutrophil/basophil) hematopoietic progenitor cell lines. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (10), 2931-2935 (1983).
  10. Valtieri, M., et al. Cytokine-dependent granulocytic differentiation. Regulation of proliferative and differentiative responses in a murine progenitor cell line. J Immunol. 138 (11), 3829-3835 (1987).
  11. Dong, F., et al. Mutations in the gene for the granulocyte colony-stimulating-factor receptor in patients with acute myeloid leukemia preceded by severe congenital neutropenia. N Engl J Med. 333 (8), 487-493 (1995).
  12. Jorda, M. A., Lowenberg, B., Delwel, R. The peripheral cannabinoid receptor Cb2, a novel oncoprotein, induces a reversible block in neutrophilic differentiation. Blood. 101 (4), 1336-1343 (2003).
  13. Jorda, M. A., et al. Hematopoietic cells expressing the peripheral cannabinoid receptor migrate in response to the endocannabinoid 2-arachidonoylglycerol. Blood. 99 (8), 2786-2793 (2002).
  14. Abbas, S., et al. Integrated genome-wide genotyping and gene expression profiling reveals BCL11B as a putative oncogene in acute myeloid leukemia with 14q32 aberrations. Haematologica. 99 (5), 848-857 (2014).
  15. Zhuang, D., Qiu, Y., Kogan, S. C., Dong, F. Increased CCAAT enhancer-binding protein epsilon (C/EBPepsilon) expression and premature apoptosis in myeloid cells expressing Gfi-1 N382S mutant associated with severe congenital neutropenia. J Biol Chem. 281 (16), 10745-10751 (2006).
  16. Zjablovskaja, P., et al. EVI2B is a C/EBPalpha target gene required for granulocytic differentiation and functionality of hematopoietic progenitors. Cell Death Differ. 24 (4), 705-716 (2017).
  17. Santini, V., et al. The carboxy-terminal region of the granulocyte colony-stimulating factor receptor transduces a phagocytic signal. Blood. 101 (11), 4615-4622 (2003).
  18. Liu, H., Qiu, Y., Xiao, L., Dong, F. Involvement of protein kinase Cepsilon in the negative regulation of Akt activation stimulated by granulocyte colony-stimulating factor. J Immunol. 176 (4), 2407-2413 (2006).
  19. Kelly, L. M., et al. FLT3 internal tandem duplication mutations associated with human acute myeloid leukemias induce myeloproliferative disease in a murine bone marrow transplant model. Blood. 99 (1), 310-318 (2002).
  20. Pikman, Y., et al. MPLW515L is a novel somatic activating mutation in myelofibrosis with myeloid metaplasia. PLoS Med. 3 (7), e270 (2006).
  21. Schwaller, J., et al. Transformation of hematopoietic cell lines to growth-factor independence and induction of a fatal myelo- and lymphoproliferative disease in mice by retrovirally transduced TEL/JAK2 fusion genes. EMBO J. 17 (18), 5321-5333 (1998).
  22. Drobek, A., et al. PSTPIP2, a Protein Associated with Autoinflammatory Disease, Interacts with Inhibitory Enzymes SHIP1 and Csk. J Immunol. 195 (7), 3416-3426 (2015).
  23. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. J Virol. 70 (8), 5701-5705 (1996).
  24. Alberich-Jorda, M., et al. C/EBPgamma deregulation results in differentiation arrest in acute myeloid leukemia. J Clin Invest. 122 (12), 4490-4504 (2012).
  25. Calabretta, B., Perrotti, D. The biology of CML blast crisis. Blood. 103 (11), 4010-4022 (2004).
  26. Ren, R. Mechanisms of BCR-ABL in the pathogenesis of chronic myelogenous leukaemia. Nat Rev Cancer. 5 (3), 172-183 (2005).
  27. Schuster, C., et al. The effects of Bcr-Abl on C/EBP transcription-factor regulation and neutrophilic differentiation are reversed by the Abl kinase inhibitor imatinib mesylate. Blood. 101 (2), 655-663 (2003).
  28. Chang, J. S., et al. High levels of the BCR/ABL oncoprotein are required for the MAPK-hnRNP-E2 dependent suppression of C/EBPalpha-driven myeloid differentiation. Blood. 110 (3), 994-1003 (2007).
  29. Velten, L., et al. Human haematopoietic stem cell lineage commitment is a continuous process. Nat Cell Biol. 19 (4), 271-281 (2017).
  30. Jorda, M. A., Rayman, N., Valk, P., De Wee, E., Delwel, R. Identification, characterization, and function of a novel oncogene: the peripheral cannabinoid receptor Cb2. Ann N Y Acad Sci. 996, 10-16 (2003).
  31. Wurm, A. A., et al. Disruption of the C/EBPalpha-miR-182 balance impairs granulocytic differentiation. Nat Commun. 8 (1), 46 (2017).
  32. Agliano, A. M., et al. On chromosomal instability: what is the karyotype of your 32D CI3 cell line. Blood. 95 (11), 3636-3637 (2000).
  33. Wang, G. G., et al. Quantitative production of macrophages or neutrophils ex vivo using conditional Hoxb8. Nat Methods. 3 (4), 287-293 (2006).
  34. Houston, I. B., Huang, K. J., Jennings, S. R., DeKoter, R. P. PU.1 immortalizes hematopoietic progenitors in a GM-CSF-dependent manner. Exp Hematol. 35 (3), 374-384 (2007).
  35. Calvo, K. R., Sykes, D. B., Pasillas, M., Kamps, M. P. Hoxa9 immortalizes a granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-dependent promyelocyte capable of biphenotypic differentiation to neutrophils or macrophages, independent of enforced meis expression. Mol Cell Biol. 20 (9), 3274-3285 (2000).
  36. Calvo, K. R., Sykes, D. B., Pasillas, M. P., Kamps, M. P. Nup98-HoxA9 immortalizes myeloid progenitors, enforces expression of Hoxa9, Hoxa7 and Meis1, and alters cytokine-specific responses in a manner similar to that induced by retroviral co-expression of Hoxa9 and Meis1. Oncogene. 21 (27), 4247-4256 (2002).
  37. Fossati-Jimack, L., et al. Phagocytosis is the main CR3-mediated function affected by the lupus-associated variant of CD11b in human myeloid cells. PLoS One. 8 (2), e57082 (2013).
  38. Schwable, J., et al. RGS2 is an important target gene of Flt3-ITD mutations in AML and functions in myeloid differentiation and leukemic transformation. Blood. 105 (5), 2107-2114 (2005).
  39. Worch, J., et al. The serine-threonine kinase MNK1 is post-translationally stabilized by PML-RARalpha and regulates differentiation of hematopoietic cells. Oncogene. 23 (57), 9162-9172 (2004).
  40. Rowley, J. D. Letter: A new consistent chromosomal abnormality in chronic myelogenous leukaemia identified by quinacrine fluorescence and Giemsa staining. Nature. 243 (5405), 290-293 (1973).
  41. Stam, K., et al. Evidence of a new chimeric bcr/c-abl mRNA in patients with chronic myelocytic leukemia and the Philadelphia chromosome. N Engl J Med. 313 (23), 1429-1433 (1985).
  42. Holly, S. P., Larson, M. K., Parise, L. V. The unique N-terminus of R-ras is required for Rac activation and precise regulation of cell migration. Mol Biol Cell. 16 (5), 2458-2469 (2005).
  43. Pierce, J. H., et al. Macrophage-colony-stimulating factor (CSF-1) induces proliferation, chemotaxis, and reversible monocytic differentiation in myeloid progenitor cells transfected with the human c-fms/CSF-1 receptor cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (15), 5613-5617 (1990).
  44. Pierce, J. H., et al. Signal transduction through the EGF receptor transfected in IL-3-dependent hematopoietic cells. Science. 239 (4840), 628-631 (1988).
  45. Oomen, S. P., et al. Somatostatin modulates G-CSF-induced but not interleukin-3-induced proliferative responses in myeloid 32D cells via activation of somatostatin receptor subtype 2. Hematol J. 2 (5), 322-329 (2001).
  46. Oomen, S. P., et al. Somatostatin is a selective chemoattractant for primitive (CD34(+)) hematopoietic progenitor cells. Exp Hematol. 30 (2), 116-125 (2002).
  47. Nogami, A., et al. FLT3-ITD confers resistance to the PI3K/Akt pathway inhibitors by protecting the mTOR/4EBP1/Mcl-1 pathway through STAT5 activation in acute myeloid leukemia. Oncotarget. 6 (11), 9189-9205 (2015).
  48. Rodel, J. E., Link, D. C. Suppression of apoptosis during cytokine deprivation of 32D cells is not sufficient to induce complete granulocytic differentiation. Blood. 87 (3), 858-864 (1996).
  49. Daley, G. Q., Baltimore, D. Transformation of an interleukin 3-dependent hematopoietic cell line by the chronic myelogenous leukemia-specific P210bcr/abl protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (23), 9312-9316 (1988).

Tags

Myeloid Precursor Cells32D-G-CSF-R CellsProliferationDifferentiationGenetic ModificationRetroviral TransductionBosc23 CellsRPMI-1640 MediumInterleukin-3MSCV Retroviral ConstructPCL Echo Packaging VectorPolyethylenimineDMEM MediumFetal Bovine SerumVirus ProductionVirus Titration

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Zjablovskaja, P., Danek, P., Kardosova, M., Alberich-Jorda, M. Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells. J. Vis. Exp. (132), e57033, doi:10.3791/57033 (2018).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image