확산 및 Murine 골수성 전조 32D/G-CSF-R의 셀
Summary
여기 자세한 위한 프로토콜 murine 골수성 전조 32D/G-CSF-R 셀 라인 경작, 수행 하는 바이러스 성 감염, 확산 및 감 별 법 분석 실험 수행 되 게 됩니다. 이 셀 줄은 골수성 세포 개발, 골수성 세포 성장 및 neutrophilic 분화의 유전자의 역할을 공부 하 고 적합 합니다.
Abstract
조 혈 줄기와 조상 세포 생물학의 이해 재생 의학 및 혈액 병 리 치료에 대 한 중요 한 의미를 갖는다. 가장 관련성이 높은 데이터를 취득 될 수 있다 vivo에서 모델 또는 기본 문화권을 사용 하 여에 불구 하 고 조 혈 줄기와 조상 세포의 낮은 풍부 상당히 그들의 조사에 대 한 적합 한 기술을 풀을 제한 합니다. 따라서, 세포의 사용 검사 또는 큰 휴대 번호를 필요로 하는 분석의 성능에 대 한 생물학 자료의 충분 한 생산을 수 있습니다. 여기 자세한 설명, 판독, 및 myelopoiesis 및 neutrophilic 분화에 관련 된 프로세스의 조사를 위해 사용 되는 확산 및 감 별 법 분석 실험의 해석 하는 것이 선물이. 이러한 실험 32D/G-CSF-R cytokine 종속 murine 골수성 세포 선, IL-3의 확산 및 G-CSF 차별화 능력을 보유 하 고 사용 합니다. 32D/G-CSF-R 셀을 처리 하기 위한 프로토콜 최적화 제공 하며 주요 함정 및 기술된 분석 및 예상된 결과 손상 시킬 수 있는 단점에 대해. 또한,이 문서 lentiviral retroviral 생산, 적정, 및 32D/G-CSF-R 셀의 변환에 대 한 프로토콜을 포함합니다. 이 세포의 유전자 조작 기본 조 혈 줄기와 조상 세포 또는 vivo에서 모델 결과 보완할 수 있는 기능과 분자 연구를 성공적으로 수행을 채택 될 수 있다 설명 합니다.
Introduction
조 혈 줄기 및 조상 인구 유기 체 세포 (호 중구, 호 산 구는, basophils, 및 monocytes) 골수성 계보에서를 포함 하 여 성숙한 셀의 큰 범위를 제공 합니다. Myelopoiesis, 조 혈 줄기 세포에서 골수성 세포의 생산을 구동 하는 과정 이라고 변화 하는 요구에 대 한 응답에서 골수성 세포로 성숙의 적절 한 생산 이며 스트레스와 유기 체의 적절 한 대처에 대 한 전제 조건 조건, 감염 등 혈액 손실입니다. 성숙한 골수성 세포의 부족 한 생산 병원 체, 감소 된 혈액 응고, 및 다른 생명을 위협 조건1,2를 발생할 수 있습니다. 또한, 골수성 혈통 개발에서 변경 관련 혈액 악성 종양, 급성 골수성 백혈병 (AML)3등 된 수도 있습니다. Myelopoiesis 변경 결함 세포 표면 수용 체4, 녹음 방송 요인5, 변경된 식에에서 장애 신호 경로6, 변이 형성의 결과로 같은 다양 한 이유로 인해 발생할 수 있습니다 / 7oncogenes 또는 종양 억제기 유전자8의 비활성화의 활성화.
다양 한 방법은 골수성 개발, 연구 하 고이 과정에서 특정 유전자 변경의 영향을 평가 개발 되었습니다. Myelopoiesis를 공부 하는 데 사용 하는 일반적인 방식 기본 세포와 유전자 변형 쥐를 포함 한다. 이러한 모델 생물학 관련 데이터의 수집을 허용, 하지만 그들은 특정 제한이 있다. 일차 전지를 사용 하 여 셀의 수를 제한 및 변경 유전자 발현 및 후속 생물 학적 또는 생화학 분석 가능성을 축소 하는 문화의 제한 기간 발생 합니다. 유전자 변형 쥐 비용이 고 생물 칭의의 합리적인 학위 필요. 또한, vivo에서 모델 작업 지정된 된 프로세스에 관심사의 유전자의 역할을 이해 복잡성의 정도 추가 합니다. 따라서, 이러한 제한을 우회 하는 대체 접근 필요 합니다. 셀 라인 명백한 이점이 있다: (1) 그들은 생 화 확 및 생물 학적 연구에 대 한 충분 한 자료를 생성 수 무제한 확산 능력을가지고, (2) 그들은 (최저, 녹아웃, 유전자 조작에 취약 overexpression), (3) 비용은 상대적으로 낮은, 그리고 (4) 그들은 생물 학적 단순화 특정 실험적인 접근에 필요한 정도의 허용.
부모의 일 3 (인터 루 킨-3) 종속 32D 셀 라인에서 친구 murine 백혈병 바이러스9C3H/HeJ 마우스 골 수 세포의 감염에 의해 Greenberger와 동료에 의해 1983 년에 설립 되었다. 여러 32D 클론 문학에서 설명 했다: cl-239, cl-310및 cl 1011. 32D cl-3 셀 IL 3에 증식 하 여 치료 granulocyte-콜로 니 자극 인자 (G-CSF)10시 neutrophilic 차별화를 받아야 표시 했다. 그와 반대로, 32D cl-10의 세포, IL-3 의존 하면서 원래 했다 하지 차별화 G-CSF 치료에 대 한 응답. 1995 년에 박사가 보 Touw의 그룹 retrovirally이 수용 체11의 기능적으로 중요 한 영역을 식별 하기 위해 야생 종류와 돌연변이 형태의 G-CSF 수용 체 (G-CSF-R) 32D cl-10 셀을 불리고. 이 연구 결과 마찬가지로 IL 3에 의존, 32D/G-CSF-R 세포의 생성 하지만 IL-3 G-CSF의 교체 후 6 ~ 10 일 이내 셀 격 증 하 고 irreversibly 성숙한 호 중구로 차별화를 중지 합니다. 이러한 속성 32D cl-3 및 2 개의 잘 정의 된 성장과 감 별 법 요인-일 3 G-CSF로 변조 수 murine neutrophilic 차별화의 32D/G-CSF-R 셀 단순화 된 모델을 확인 합니다. 지난 십년 동안 여러 그룹 사용 32D/G-CSF-R 셀 확산에 특정 유전자의 역할 및 문화12,13,,1415 에 골수성 세포의 분화 연구 , 16, 그리고 G-CSF 신호17,18공부 하. 중요 한 것은,이 셀 라인을 사용 하 여 얻은 결과 기본 세포와 유전자 변형 마우스16,19,,2021얻은 데이터와 상관 된다. 따라서, 우리가 널리 사용 하 고 잘 설립 모델, 32D/G-CSF-R 셀 골수성 차별화 병행이이 문제를 해결 하는 다른 접근에 사용 될 수 있는 연구에 귀중 한 시스템 대표 믿습니다.
여기, 상세한 프로토콜 32D/G-CSF-R 셀 라인의 처리를 설명 하는 커버 확장, 차별화, 및 확산의 평가 및 이러한 셀의 제공 됩니다. 32D/G-CSF-R 세포의 유전 수정에 대 한 자세한 정보를 retroviral 또는 lentiviral 변환 뿐만 아니라 바이러스 적정에 대 한 프로토콜에 의해 제공 됩니다. 또한, 32D/G-CSF-R 세포의 잠재적인 응용 프로그램을 보여 주는 몇 가지 대표적인 결과 제공 됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
실험적인 모델의 연구의 주요 문제 중 하나입니다. 기본 인간과 동물 세포 가장 생물학적으로 관련 데이터를 생산으로, 이러한 모델 윤리적 우려를 포함할 수 있습니다 고은 종종 비싼 및 정교한 분리/배양 절차와 관련 된. 1 차 셀 숫자에 제한 됩니다 그리고 유전자 조작 하기 어렵다. 또한, 1 차 셀 데이터 해석29을 복잡 하 게 수 있습니다 다양 한 세포 유형의 구성 유형이 다른 ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 교수 뤼트 Delwel 및 32D/G-CSF-R 셀 라인, 우리를 제공 하기 위한 교수가 보 Touw 및 Bosc23 셀 선 제공에 대 한 교수 다니엘 G. 되어 감사 합니다. 이 작품 MA j 체코 공화국 (GACR 15-03796S 및 GACR 17-02177S)의 그랜트의 교부 금에 의해 지원 되었다, MA-j, GA 영국 원정대 (프로젝트 번호 341015) 체코 과학 아카데미 (RVO 68378050)의 분자 유전학 연구소에서 지원 PD 프라하 찰스 대학교에서 MK, 하가 영국 원정대 (프로젝트 번호 1278217) 프라하에 있는 찰리 대학.
Materials
| RPMI 1640 powder medium | Merck, Kenilworth, NJ, USA | T 121-10 | without NaHCO3, with L-glutamine |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15028 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 31985-047 | L-Glutamine, Phenol Red |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAA Laboratories (GE Healthcare,Chicago, IL, USA) | MT35011CV | For differentiation of 32D/G-CSF-R cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270 | Used for culturing HEK293T, NIH3T3, BOSC23 cells |
| Penicillin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | P3032 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | S9137 | Streptomycin sulfate salt powder |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | G1914 | |
| murine IL-3 | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA | 213-13 | |
| human G-CSF | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA | 300-23 | |
| Polyethylenimine | Polyscience, Warrington, PA, USA | 23966 | Linear, MW 25,000 (PEI 25000) |
| Polybrene | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | H9268 | |
| Trypsin | VWR Chemicals, Radnor, PA, USA | 0458 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | E5134 | |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | C0775 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | T6146 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | D2650 | |
| May-Grünwald Giemsa | DiaPath, Martinengo, BG, Italy | 10802 |
Referencias
- Bonilla, M. A., et al. Effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor on neutropenia in patients with congenital agranulocytosis. N Engl J Med. 320 (24), 1574-1580 (1989).
- Bennett, C. L., Djulbegovic, B., Norris, L. B., Armitage, J. O. Colony-stimulating factors for febrile neutropenia during cancer therapy. N Engl J Med. 368 (12), 1131-1139 (2013).
- Lowenberg, B., Downing, J. R., Burnett, A. Acute myeloid leukemia. N Engl J Med. 341 (14), 1051-1062 (1999).
- Dong, F., et al. Identification of a nonsense mutation in the granulocyte-colony-stimulating factor receptor in severe congenital neutropenia. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (10), 4480-4484 (1994).
- Rosenbauer, F., Tenen, D. G. Transcription factors in myeloid development: balancing differentiation with transformation. Nat Rev Immunol. 7 (2), 105-117 (2007).
- Kota, J., Caceres, N., Constantinescu, S. N. Aberrant signal transduction pathways in myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 22 (10), 1828-1840 (2008).
- Kvinlaug, B. T., et al. Common and overlapping oncogenic pathways contribute to the evolution of acute myeloid leukemias. Cancer Res. 71 (12), 4117-4129 (2011).
- Krug, U., Ganser, A., Koeffler, H. P. Tumor suppressor genes in normal and malignant hematopoiesis. Oncogene. 21 (21), 3475-3495 (2002).
- Greenberger, J. S., Sakakeeny, M. A., Humphries, R. K., Eaves, C. J., Eckner, R. J. Demonstration of permanent factor-dependent multipotential (erythroid/neutrophil/basophil) hematopoietic progenitor cell lines. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (10), 2931-2935 (1983).
- Valtieri, M., et al. Cytokine-dependent granulocytic differentiation. Regulation of proliferative and differentiative responses in a murine progenitor cell line. J Immunol. 138 (11), 3829-3835 (1987).
- Dong, F., et al. Mutations in the gene for the granulocyte colony-stimulating-factor receptor in patients with acute myeloid leukemia preceded by severe congenital neutropenia. N Engl J Med. 333 (8), 487-493 (1995).
- Jorda, M. A., Lowenberg, B., Delwel, R. The peripheral cannabinoid receptor Cb2, a novel oncoprotein, induces a reversible block in neutrophilic differentiation. Blood. 101 (4), 1336-1343 (2003).
- Jorda, M. A., et al. Hematopoietic cells expressing the peripheral cannabinoid receptor migrate in response to the endocannabinoid 2-arachidonoylglycerol. Blood. 99 (8), 2786-2793 (2002).
- Abbas, S., et al. Integrated genome-wide genotyping and gene expression profiling reveals BCL11B as a putative oncogene in acute myeloid leukemia with 14q32 aberrations. Haematologica. 99 (5), 848-857 (2014).
- Zhuang, D., Qiu, Y., Kogan, S. C., Dong, F. Increased CCAAT enhancer-binding protein epsilon (C/EBPepsilon) expression and premature apoptosis in myeloid cells expressing Gfi-1 N382S mutant associated with severe congenital neutropenia. J Biol Chem. 281 (16), 10745-10751 (2006).
- Zjablovskaja, P., et al. EVI2B is a C/EBPalpha target gene required for granulocytic differentiation and functionality of hematopoietic progenitors. Cell Death Differ. 24 (4), 705-716 (2017).
- Santini, V., et al. The carboxy-terminal region of the granulocyte colony-stimulating factor receptor transduces a phagocytic signal. Blood. 101 (11), 4615-4622 (2003).
- Liu, H., Qiu, Y., Xiao, L., Dong, F. Involvement of protein kinase Cepsilon in the negative regulation of Akt activation stimulated by granulocyte colony-stimulating factor. J Immunol. 176 (4), 2407-2413 (2006).
- Kelly, L. M., et al. FLT3 internal tandem duplication mutations associated with human acute myeloid leukemias induce myeloproliferative disease in a murine bone marrow transplant model. Blood. 99 (1), 310-318 (2002).
- Pikman, Y., et al. MPLW515L is a novel somatic activating mutation in myelofibrosis with myeloid metaplasia. PLoS Med. 3 (7), e270 (2006).
- Schwaller, J., et al. Transformation of hematopoietic cell lines to growth-factor independence and induction of a fatal myelo- and lymphoproliferative disease in mice by retrovirally transduced TEL/JAK2 fusion genes. EMBO J. 17 (18), 5321-5333 (1998).
- Drobek, A., et al. PSTPIP2, a Protein Associated with Autoinflammatory Disease, Interacts with Inhibitory Enzymes SHIP1 and Csk. J Immunol. 195 (7), 3416-3426 (2015).
- Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. J Virol. 70 (8), 5701-5705 (1996).
- Alberich-Jorda, M., et al. C/EBPgamma deregulation results in differentiation arrest in acute myeloid leukemia. J Clin Invest. 122 (12), 4490-4504 (2012).
- Calabretta, B., Perrotti, D. The biology of CML blast crisis. Blood. 103 (11), 4010-4022 (2004).
- Ren, R. Mechanisms of BCR-ABL in the pathogenesis of chronic myelogenous leukaemia. Nat Rev Cancer. 5 (3), 172-183 (2005).
- Schuster, C., et al. The effects of Bcr-Abl on C/EBP transcription-factor regulation and neutrophilic differentiation are reversed by the Abl kinase inhibitor imatinib mesylate. Blood. 101 (2), 655-663 (2003).
- Chang, J. S., et al. High levels of the BCR/ABL oncoprotein are required for the MAPK-hnRNP-E2 dependent suppression of C/EBPalpha-driven myeloid differentiation. Blood. 110 (3), 994-1003 (2007).
- Velten, L., et al. Human haematopoietic stem cell lineage commitment is a continuous process. Nat Cell Biol. 19 (4), 271-281 (2017).
- Jorda, M. A., Rayman, N., Valk, P., De Wee, E., Delwel, R. Identification, characterization, and function of a novel oncogene: the peripheral cannabinoid receptor Cb2. Ann N Y Acad Sci. 996, 10-16 (2003).
- Wurm, A. A., et al. Disruption of the C/EBPalpha-miR-182 balance impairs granulocytic differentiation. Nat Commun. 8 (1), 46 (2017).
- Agliano, A. M., et al. On chromosomal instability: what is the karyotype of your 32D CI3 cell line. Blood. 95 (11), 3636-3637 (2000).
- Wang, G. G., et al. Quantitative production of macrophages or neutrophils ex vivo using conditional Hoxb8. Nat Methods. 3 (4), 287-293 (2006).
- Houston, I. B., Huang, K. J., Jennings, S. R., DeKoter, R. P. PU.1 immortalizes hematopoietic progenitors in a GM-CSF-dependent manner. Exp Hematol. 35 (3), 374-384 (2007).
- Calvo, K. R., Sykes, D. B., Pasillas, M., Kamps, M. P. Hoxa9 immortalizes a granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-dependent promyelocyte capable of biphenotypic differentiation to neutrophils or macrophages, independent of enforced meis expression. Mol Cell Biol. 20 (9), 3274-3285 (2000).
- Calvo, K. R., Sykes, D. B., Pasillas, M. P., Kamps, M. P. Nup98-HoxA9 immortalizes myeloid progenitors, enforces expression of Hoxa9, Hoxa7 and Meis1, and alters cytokine-specific responses in a manner similar to that induced by retroviral co-expression of Hoxa9 and Meis1. Oncogene. 21 (27), 4247-4256 (2002).
- Fossati-Jimack, L., et al. Phagocytosis is the main CR3-mediated function affected by the lupus-associated variant of CD11b in human myeloid cells. PLoS One. 8 (2), e57082 (2013).
- Schwable, J., et al. RGS2 is an important target gene of Flt3-ITD mutations in AML and functions in myeloid differentiation and leukemic transformation. Blood. 105 (5), 2107-2114 (2005).
- Worch, J., et al. The serine-threonine kinase MNK1 is post-translationally stabilized by PML-RARalpha and regulates differentiation of hematopoietic cells. Oncogene. 23 (57), 9162-9172 (2004).
- Rowley, J. D. Letter: A new consistent chromosomal abnormality in chronic myelogenous leukaemia identified by quinacrine fluorescence and Giemsa staining. Nature. 243 (5405), 290-293 (1973).
- Stam, K., et al. Evidence of a new chimeric bcr/c-abl mRNA in patients with chronic myelocytic leukemia and the Philadelphia chromosome. N Engl J Med. 313 (23), 1429-1433 (1985).
- Holly, S. P., Larson, M. K., Parise, L. V. The unique N-terminus of R-ras is required for Rac activation and precise regulation of cell migration. Mol Biol Cell. 16 (5), 2458-2469 (2005).
- Pierce, J. H., et al. Macrophage-colony-stimulating factor (CSF-1) induces proliferation, chemotaxis, and reversible monocytic differentiation in myeloid progenitor cells transfected with the human c-fms/CSF-1 receptor cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (15), 5613-5617 (1990).
- Pierce, J. H., et al. Signal transduction through the EGF receptor transfected in IL-3-dependent hematopoietic cells. Science. 239 (4840), 628-631 (1988).
- Oomen, S. P., et al. Somatostatin modulates G-CSF-induced but not interleukin-3-induced proliferative responses in myeloid 32D cells via activation of somatostatin receptor subtype 2. Hematol J. 2 (5), 322-329 (2001).
- Oomen, S. P., et al. Somatostatin is a selective chemoattractant for primitive (CD34(+)) hematopoietic progenitor cells. Exp Hematol. 30 (2), 116-125 (2002).
- Nogami, A., et al. FLT3-ITD confers resistance to the PI3K/Akt pathway inhibitors by protecting the mTOR/4EBP1/Mcl-1 pathway through STAT5 activation in acute myeloid leukemia. Oncotarget. 6 (11), 9189-9205 (2015).
- Rodel, J. E., Link, D. C. Suppression of apoptosis during cytokine deprivation of 32D cells is not sufficient to induce complete granulocytic differentiation. Blood. 87 (3), 858-864 (1996).
- Daley, G. Q., Baltimore, D. Transformation of an interleukin 3-dependent hematopoietic cell line by the chronic myelogenous leukemia-specific P210bcr/abl protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (23), 9312-9316 (1988).
