Presentamos un método para cuantificar los fenotipos de crecimiento de células de levadura individuales a medida que crecen en colonias en medios sólidos usando microscopía de lapso de tiempo denominada Evaluación de Duplicación de células vivas de levaduras (ODELAY). La heterogeneidad de la población de células genéticamente idénticas que crecen en colonias puede observarse y cuantificarse directamente.
Los fenotipos de crecimiento de los microorganismos son un fuerte indicador de su aptitud genética subyacente y pueden segregarse en 3 regímenes de crecimiento: lag-phase, log-phase y stationary-phase. Cada fase de crecimiento puede revelar diferentes aspectos de la aptitud que están relacionados con diversas condiciones ambientales y genéticas. Las mediciones de alta resolución y cuantitativas de las 3 fases de crecimiento son generalmente difíciles de obtener. Aquí presentamos un método detallado para caracterizar todas las 3 fases de crecimiento en medios sólidos utilizando un ensayo denominado Evaluación de Duplicación de Celda de Arrays Vivientes de Levadura (ODELAY). ODELAY cuantifica los fenotipos de crecimiento de las células individuales que crecen en colonias en medios sólidos usando microscopía de lapso de tiempo. Este método puede observar directamente la heterogeneidad de la población con cada parámetro de crecimiento en células genéticamente idénticas que crecen en colonias. Esta heterogeneidad de población ofrece una perspectiva única para entender la regulación genética y epigenética, y las respuestas aGenéticas y ambientales. Aunque el método ODELAY se demuestra usando levadura, puede ser utilizado en cualquier microorganismo formador de colonias que sea visible por microscopía de campo brillante.
Los fenotipos de crecimiento de microorganismos son un fuerte indicador de su aptitud genética subyacente a una condición ambiental dada. El crecimiento se clasifica clásicamente en 3 regímenes de crecimiento diferentes: fase de retraso, fase logarítmica y crecimiento en fase estacionaria 1 . Cada fase de crecimiento puede revelar diferentes aspectos de la aptitud que dependen de diversas condiciones ambientales y genéticas. Por ejemplo, el tiempo de retraso, o la cantidad de tiempo que un organismo pasa en fase de retraso antes del inicio del crecimiento exponencial, puede ser indicativo de la capacidad de un organismo para responder a condiciones ambientales alteradas 2 . El tiempo de duplicación durante el crecimiento de la fase logarítmica, la métrica más común de aptitud celular, revela la eficiencia global de la capacidad de un organismo para dividirse metabolizando y utilizando materiales ambientales para la replicación. La fase estacionaria, donde el crecimiento después de la fase logarítmica se reduce rápidamente, es otro indicador de aptitud, que es regularUtilizado como punto final de crecimiento en ensayos de crecimiento de levadura a base de manchas.
Varios ensayos de crecimiento de levadura están actualmente disponibles y se consideran métodos estándar para evaluar los fenotipos de crecimiento en levaduras 3 , 4 , 5 . Estos ensayos se basan principalmente en métodos para cultivar levadura ya sea en medio sólido o líquido. En medios sólidos, los ensayos de fijación de colonias transfieren un pequeño número de células sobre agar sólido con un alfiler, y las células de levadura se dejan crecer durante un periodo de tiempo definido. A continuación se forman imágenes de las colonias y se comparan sus tamaños en un extremo terminal 6 . Estos ensayos de fijación de colonias han demostrado ser robustos y escalables para generar pantallas de todo el genoma. Más recientemente, se han incorporado imágenes periódicas utilizando escáneres de lecho plano y cámaras SLR (Single Lens Reflex) en estos ensayos para registrar el crecimiento de colonias a lo largo del tiempo 7 , 8, 9 . Sin embargo, la resolución de estos dispositivos les impide detectar células individuales y, por lo tanto, estos ensayos de fijación de colonias no observan directamente el tiempo de retraso y no pueden observar la variación entre las células individuales que crecen en colonias.
También se han empleado ensayos de crecimiento a base de líquido para realizar pantallas de todo el genoma 3 . El acoplamiento de un ensayo de crecimiento líquido con microscopía de lapso de tiempo reveló heterogeneidad de la población en el tiempo de duplicación de células individuales genéticamente idénticas, lo que ofrece una perspectiva importante para comprender la regulación genética y la adaptación al medio ambiente. Sin embargo, este ensayo no mide otros aspectos del crecimiento tales como tiempo de retraso y capacidad de carga 10 . Aquí presentamos un método para caracterizar las tres fases de crecimiento de microorganismos formadores de colonias en medios sólidos usando un ensayo que denominamos ODELAY 11 . ODELAY consiste en utiliZing de alto rendimiento lapso de tiempo de microscopía para registrar imágenes de células individuales que crecen en colonias en medios sólidos. Esta población de células individuales que crecen en colonias revela la heterogeneidad de la población subyacente, que no es detectada por otras mediciones menos sensibles como la puntuación terminal. Se demuestra el método de la levadura, pero ODELAY puede aplicarse a cualquier organismo que muestra el contraste en microscopía de campo brillante.
El ensayo ODELAY tiene varios puntos críticos para asegurar mediciones fenotípicas reproducibles y confiables. El primer punto crítico es la preparación consistente de los cultivos de levadura. Se debe tener cuidado de recoger las células de levadura de crecimiento logarítmico. Si los cultivos se han saturado, entonces su heterogeneidad de la población se incrementará lo que puede obscurecer la heterogeneidad causada por factores genéticos o ambientales ( por ejemplo, la fuente de carbono) 11 . El segundo punto crítico es la preparación consistente de los medios de comunicación. En general, se debe generar un gran volumen de solución de material de almacenamiento 10X y luego utilizarse con el tiempo para minimizar los efectos de los lotes. Formular los medios en peso, siempre que sea posible, ayuda a mejorar la consistencia del medio a lo largo del tiempo, asegurando que la densidad de agar y el contenido global en agua de la agarosa pueden ser monitorizados de cerca. El tercer punto crítico consiste en minimizar o eliminar cualquier deformación mecánica de la agarosa meDia La deformación mecánica del medio ocurrirá más frecuentemente durante la separación de la agarosa de las diapositivas de vidrio. Como con muchas técnicas de laboratorio, la práctica es necesaria para dominar este paso.
La variación en el tiempo de retardo, como se muestra en la Figura 4 , se relaciona a menudo con uno de los tres factores: deformación mecánica del medio de agarosa, variación en el espesor de agar moldeado o una fuente de luz inestable. Si el medio de agarosa varía en la altura Z a través de la matriz manchada, la variación de altura puede sobrepasar el rango de la rutina de enfoque automático, causando que las imágenes iniciales estén ligeramente fuera de foco. Por esta razón, compruebe la altura de enfoque en varios puntos en el centro ya lo largo de los bordes de la matriz manchada para asegurarse de que la rutina de enfoque automático tiene suficiente rango Z para encontrar el enfoque. Si es necesario, utilice el panel Autofocus para aumentar el rango de enfoque y aumentar el número de pasos de enfoque.
Un tercer condicion posibleIon que puede conducir a un enfoque deficiente es una fuente de luz inestable o parpadeante, que puede interrumpir la puntuación de enfoque calculado para una altura Z específica. Las bombillas halógenas de tungsteno tienden a parpadear bien antes de que los bulbos se quemen. El efecto de un enfoque deficiente se observa en un ejemplo en el que las curvas de crecimiento se sumergen entre el primer y segundo puntos temporales ( Figura 5A ), mientras que el punto adyacente no tiene la misma inclinación ( Figura 5B ). En este caso, la mala condición de enfoque se alivió reemplazando la fuente de luz halógena de tungsteno.
En la práctica, los autores han encontrado que para reducir el parpadeo de bulbos halógenos de tungsteno de 100W, los bulbos necesitan ser reemplazados cada 500 horas o aproximadamente cada 2 meses cuando los microscopios están bajo uso intensivo. Para evitar problemas de enfoque deficiente de una bombilla parpadeante, reemplace la fuente de luz halógena de tungsteno a menudo o reemplace la bombilla halógena con una fuente de luz de diodo. UnEl ejemplo de un conjunto de datos que muestra una baja variación en los tiempos de duplicación así como tiempos de retraso más uniformes se muestra en la Figura 6 . Este conjunto de datos se tomó con un iluminador de diodo que proporciona una iluminación más estable con el tiempo mientras se realiza el autofoco.
Aunque muchos de los puntos mencionados aquí para optimizar la preparación de los medios pueden parecer obvios, en la literatura la mayoría de las pantallas a gran escala no se replican bien entre sí 8 , 11 . Por lo tanto, hemos descrito cuidadosamente la preparación de cultivos y medios de agarosa para que se puedan generar pantallas fenotípicas más reproducibles.
El ensayo ODELAY está actualmente limitado en rendimiento cuando se compara con ensayos basados en fijación tales como matrices genéticas sintéticas o el análisis Scan-O-Matic. Aunque estos métodos aumentan el número de cepas que se miden, carecen de la capacidad de resolver células individuales aNd por lo tanto no puede medir la heterogeneidad de la población que observamos dentro de las cepas clonales de levadura. El origen de esta heterogeneidad de la población no se entiende actualmente, pero la fusión de la tecnología y la computación como se demuestra aquí ofrece una oportunidad para abordar objetivamente los mecanismos celulares subyacentes [ 12] .
Los autores desean notar que ODELAY actualmente sólo está optimizado para una marca de microscopio y tipo de cuerpo específicos. Modificar ODELAY para otros sistemas del microscopio es directo pero requerirá conocimiento de la fuente abierta API 13 . Sin embargo, tanto la API como los scripts ODELAY se escriben para adaptarse fácilmente a diferentes sistemas y ensayos experimentales.
Mientras ODELAY fue desarrollado originalmente para la levadura, hemos sido capaces de utilizarlo sin modificación para observar el crecimiento de Mycobacterium smegmatis . La observación de los otros microorganismos formadores de colonias esPosible con modificaciones del código fuente proporcionado 11 . En general, ODELAY es una herramienta poderosa y flexible para comparar microorganismos cultivados bajo diferentes condiciones ambientales y perturbaciones genéticas.
The authors have nothing to disclose.
Los autores reconocen el apoyo a este trabajo por las subvenciones U54 RR022220 y P50 GM076547 a JDA de los EE.UU. National Institutes of Health. FDM es un becario postdoctoral de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud. También damos las gracias al Centro de Biomedicina de Sistemas de Luxemburgo ya la Universidad de Luxemburgo por su apoyo.
Agarose UltraPure | ThermoFisher | 16500500 | Gel Temp 36C, Gel Strength (1%) 1.2g/sq cm |
Yeast Extract Peptone (YEP) | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
Complete Suplement Mixture (CSM) | Fisher Scientific | MP114560222 | |
Polyethylene Glycol 3350 (av. mol. wt. 3000-3700) | SigmaAldrich | P2906 | |
Yeast Strain BY4741 | ThermoFisher | 95400.BY4741 | |
Yeast Strain BY4742 | ThermoFisher | 95400.BY4742 | |
50mL Falcon tubes | Corning | 430291 | 1 case |
15mL Falcon tubes | Corning | 352096 | |
2 x 3 inch 1.0mm thick slides 1/2 gross | VWR | 48382-179 | |
96 well plate flat bottom | Corning | 353072 | |
Hydra liquid handleing robot | Thermo | 1096-DT-100 | |
Hamilton Microlab Star Liquid Handleing Robot | Hamilton | ||
hydra 100 mL tips Extended Length DARTS | Thermo | 5527 | |
Synergy H4 Plate Reader | Biotek | H4MLFAD | |
Leica DMI6000 B Microscope | Leica | ||
Leica 10X/0.3NA objective | Leica | 11506289 | |
Hamamatsu ORCA Flash 4.0 Camera | Hamamatsu | C11440-22CU | |
MATLAB with image processing tool box | Mathworks | ||
MicroManager | Open Imaging | https://micro-manager.org/ | |
ODELAY Microscope Control (MATLAB scripts and GUI) | www.aitchisonlab.comODELAY for Matlab scripts and software | ||
ODELAY Microscope Chamber | www.aitchisonlab.comODELAY for Mechanincal Drawings | ||
ODELAY Agar Molds | www.aitchisonlab.comODELAY for mold drawings |