أوديلاي: طريقة على نطاق واسع لالمعلمات المتعددة الكمي للنمو الخميرة
Summary
نقدم طريقة لقياس النماذج الظاهرية للنمو من خلايا الخميرة الفردية لأنها تنمو إلى مستعمرات على وسائل الإعلام الصلبة باستخدام الوقت الفاصل بين المجهري وصفت، خلية واحدة مضاعفة تقييم صفائف المعيشة من الخميرة (أوديلاي). ويمكن ملاحظة عدم التجانس السكاني للخلايا المتطابقة وراثيا المتزايد في المستعمرات بشكل مباشر وكمي.
Abstract
النمو الظواهر من الكائنات الحية الدقيقة هي مؤشر قوي على اللياقة البدنية الجينية الكامنة ويمكن فصلها إلى 3 أنظمة النمو: مرحلة تأخر، مرحلة السجل، ومرحلة ثابتة. كل مرحلة نمو يمكن أن تكشف عن جوانب مختلفة من اللياقة البدنية التي ترتبط مختلف الظروف البيئية والجينية. ومن الصعب عموما الحصول على قياسات عالية الدقة وكمية لجميع مراحل النمو الثلاث. هنا نقدم طريقة مفصلة لتوصيف جميع مراحل النمو 3 على وسائل الاعلام الصلبة باستخدام مقايسة يسمى خلية واحدة مضاعفة تقييم صفائف المعيشة من الخميرة (أوديلاي). أوديلاي يحدد النماذج الظاهرية للنمو من الخلايا الفردية المتنامية إلى مستعمرات على وسائل الإعلام الصلبة باستخدام الفاصل الزمني الفاصل الزمني. هذه الطريقة يمكن أن يلاحظ مباشرة التغاير السكاني مع كل معلمة النمو في الخلايا المتطابقة وراثيا المتنامية في المستعمرات. هذا التباين السكاني يقدم منظورا فريدا لفهم التنظيم الجيني والتخلق الوراثي، والاستجابات لوالاضطرابات الجينية والبيئية. في حين أثبتت طريقة أوديلاي باستخدام الخميرة، ويمكن استخدامه على أي مستعمرة تشكيل الكائنات الحية الدقيقة التي مرئية من قبل المجهر الميدان مشرق.
Introduction
النمو الظاهري من الكائنات الدقيقة هي مؤشر قوي على اللياقة البدنية الكامنة وراءها إلى حالة بيئية معينة. يتم فصل النمو بشكل كلاسيكي إلى 3 أنظمة نمو مختلفة: مرحلة التأخر، مرحلة السجل، ونمو المرحلة الثابتة 1 . كل مرحلة نمو يمكن أن تكشف عن جوانب مختلفة من اللياقة البدنية التي تعتمد على مختلف الظروف البيئية والجينية. على سبيل المثال، وقت التأخر، أو طول الوقت الذي ينفقه الكائن الحي في مرحلة التأخر قبل بداية النمو الأسي، يمكن أن يكون مؤشرا على قدرة الكائن الحي على الاستجابة للظروف البيئية المتغيرة 2 . الوقت مضاعفة خلال النمو مرحلة سجل، المقياس الأكثر شيوعا من اللياقة الخلوية، ويكشف عن الكفاءة الكلية لقدرة الكائن الحي على تقسيم عن طريق التمثيل الغذائي واستخدام المواد البيئية للتكرار. المرحلة الثابتة، حيث النمو بعد تسجيل مرحلة خفض بسرعة، هو مؤشر آخر على اللياقة البدنية، والذي هو منتظملي تستخدم كنقطة نهاية النمو في المقايسات النمو الخميرة القائمة على بقعة.
العديد من المقايسات نمو الخميرة المتاحة حاليا وتعتبر الطرق القياسية لتقييم الظواهر النمو في الخميرة 3 ، 4 ، 5 . وتستند هذه المقايسات في المقام الأول على أساليب لزراعة الخميرة سواء على وسائل الإعلام الصلبة أو في السائل. على وسائل الاعلام الصلبة، فحوصات تربط مستعمرة نقل عدد قليل من الخلايا على أجار الصلبة مع دبوس، وخلايا الخميرة يسمح للنمو لفترة محددة من الزمن. ثم يتم تصوير المستعمرات ويتم مقارنة أحجامها عند نقطة النهاية النهائية 6 . وقد أثبتت هذه المقايسات تعلق مستعمرة قوية وقابلة للتوليد لتوليد شاشات على نطاق الجينوم. في الآونة الأخيرة، تم دمج التصوير الدوري باستخدام الماسحات الضوئية المسطحة والكاميرات عدسة واحدة ريفلكس (سلر) في هذه المقايسات لتسجيل نمو مستعمرة مع مرور الوقت 7 ، 8، 9 . ومع ذلك، فإن حل هذه الأجهزة يمنعهم من الكشف عن خلايا واحدة، وبالتالي فإن هذه المقايسات تعلق مستعمرة لا تلاحظ مباشرة تأخر الوقت ولا يمكن أن نلاحظ الاختلاف بين الخلايا الفردية التي تنمو لتصبح مستعمرات.
كما تم استخدام مقايسات النمو المستندة إلى السائل لأداء الشاشات على نطاق الجينوم 3 . أظهر اقتران مقايسة النمو السائل مع الفحص المجهري الفاصل الزمني عدم التجانس السكاني في الوقت مضاعفة من الخلايا الفردية متطابقة وراثيا، والذي يوفر منظورا هاما لفهم التنظيم الجيني والتكيف البيئي. ومع ذلك، هذا المقياس لا يقيس جوانب أخرى من النمو مثل الوقت تأخر والقدرة على التحمل 10 . هنا نقدم طريقة لتوصيف كل مراحل النمو الثلاث من مستعمرة تشكيل الكائنات الحية الدقيقة على وسائل الإعلام الصلبة باستخدام مقايسة نحن مصطلح أوديلاي 11 . أوديلاي يتكون من أوتيليزينغ عالية الإنتاجية الوقت الفاصل بين المجهري لتسجيل الصور من خلايا واحدة تنمو إلى مستعمرات على وسائل الإعلام الصلبة. هذا السكان من الخلايا الفردية التي تنمو إلى مستعمرات تكشف عن عدم التجانس السكان الكامنة، والتي لم يتم الكشف عن غيرها من القياسات أقل حساسية مثل التهديف نهاية نقطة التهديف. علينا أن نظهر طريقة على الخميرة، ولكن أوديلاي يمكن تطبيقها على أي الكائن الذي يظهر التباين في مجال الفحص المجهري مشرق.
Protocol
Representative Results
Discussion
فحص أوديلاي لديه عدة نقاط حاسمة لضمان القياسات المظهرية يمكن الاعتماد عليها وموثوق بها. النقطة الحرجة الأولى هي إعداد ثابت للثقافات الخميرة. يجب توخي الحذر لحصاد خلايا الخميرة من النمو اللوغاريتمي. إذا كانت الثقافات قد المشبعة، ثم سيتم زيادة عدم التجانس سكانها والتي قد تشوش عدم التجانس الناجم عن العوامل الوراثية أو البيئية (على سبيل المثال، مصدر الكربون) 11 . النقطة الحرجة الثانية هي التحضير المستمر لوسائل الإعلام. بشكل عام، ينبغي إنشاء كمية كبيرة من 10X حل وسائل الإعلام الأسهم ثم استخدامها على مر الزمن لتقليل آثار دفعة. إن صياغة وسائل الإعلام بالوزن، كلما أمكن، يساعد على تحسين اتساق الوسط مع مرور الوقت من خلال ضمان كثافة الأجار والمحتوى الكلي للماء من الاغاروز يمكن رصدها عن كثب. النقطة الحرجة الثالثة تنطوي على تقليل أو القضاء على أي تشوه الميكانيكية للأغاروز ليديا. التشوه الميكانيكي للوسائط الأكثر شيوعا يحدث أثناء فصل الاغاروز عن الشرائح الزجاجية. كما هو الحال مع العديد من التقنيات المخبرية، مطلوب الممارسة لإتقان هذه الخطوة.
التباين في وقت التأخر كما هو مبين في الشكل 4 ، وغالبا ما ترتبط واحدة من العوامل الثلاثة: تشوه الميكانيكية من وسط الاغاروز، والاختلاف في سمك أجار مصبوب، أو مصدر ضوء غير مستقر. إذا كان الوسيط الاغاروز يختلف في Z- الارتفاع عبر مجموعة رصدت، قد تطغى ارتفاع الارتفاع نطاق روتين ضبط تلقائي للصورة، مما تسبب في الصور الأولية لتكون قليلا من التركيز. لهذا السبب، والتحقق من ارتفاع التركيز في بقع متعددة في المركز وعلى طول حواف مجموعة رصدت لضمان روتين ضبط تلقائي للصورة لديه ما يكفي من Z- مجموعة للعثور على التركيز. إذا لزم الأمر، استخدم لوحة ضبط تلقائي للصورة لزيادة نطاق التركيز وزيادة عدد خطوات التركيز.
شرط ثالث ممكنأيون التي قد تؤدي إلى ضعف التركيز هو مصدر الضوء غير مستقر أو الخفقان، والتي يمكن أن تعطل درجة التركيز المحسوبة ل Z- الارتفاع محددة. تنغستن لمبات الهالوجين تميل إلى وميض جيدا قبل المصابيح تحترق. ويلاحظ تأثير ضعف التركيز في مثال واحد حيث تنحني منحنيات النمو بين النقاط الزمنية الأولى والثانية ( الشكل 5 A )، في حين أن البقعة المجاورة ليس لديها نفس الانخفاض ( الشكل 5 B ). في هذه الحالة، تم تخفيف حالة التركيز الفقراء عن طريق استبدال مصدر ضوء الهالوجين التنغستن.
في الممارسة العملية، وجد الباحثون أن للحد من وميض من 100W لمبات الهالوجين التنغستن، تحتاج المصابيح لتحل محل كل 500 ساعة أو تقريبا كل 2 أشهر عندما المجاهر هي تحت الاستخدام الكثيف. لتجنب قضايا التركيز الفقراء من لمبة الخفقان، واستبدال مصدر ضوء الهالوجين التنغستن في كثير من الأحيان أو استبدال لمبة الهالوجين مع مصدر ضوء الصمام الثنائي. لمثال على مجموعة البيانات التي تظهر تباين منخفض في أوقات مضاعفة وكذلك فترات تأخر أكثر اتساقا هو مبين في الشكل 6 . وقد اتخذت هذه البيانات مع إضاءة الصمام الثنائي الذي يوفر إضاءة أكثر استقرارا مع مرور الوقت أثناء تنفيذ ضبط تلقائي للصورة.
في حين أن العديد من النقاط المذكورة هنا لتحسين إعداد وسائل الإعلام قد تبدو واضحة، في الأدب معظم الشاشات على نطاق واسع لا تكرار جيدا مع بعضها البعض 8 ، 11 . ولذلك، فقد وصفنا بعناية إعداد الثقافات ووسائل الإعلام الاغاروز بحيث يمكن إنشاء شاشات المظهري أكثر استنساخا.
مقايسة أوديلاي محدودة حاليا في الإنتاجية عند مقارنته بتثبيت الفحوصات القائمة مثل المصفوفات الجينية الاصطناعية أو فحص المسح الضوئي- O- ماتيك. في حين أن هذه الأساليب تزيد من عدد من السلالات التي يتم قياسها، فإنها تفتقر إلى القدرة على حل الخلايا الفردية أوبالتالي لا يمكن قياس التغاير السكاني التي نلاحظ داخل سلالات الخميرة نسلي. أصل هذا التغاير السكاني ليس مفهوما حاليا، ولكن دمج التكنولوجيا والحساب كما هو موضح هنا يتيح فرصة لمعالجة موضوعية الآليات الخلوية الكامنة 12 .
ويود المؤلفون أن نلاحظ أن أوديلاي هو الأمثل حاليا فقط للعلامة التجارية المجهر محددة ونوع الجسم. تعديل أوديلاي لأنظمة المجهر الأخرى هو على التوالي إلى الأمام ولكن سوف تتطلب معرفة أبي المصدر المفتوح 13 . ومع ذلك، يتم كتابة كل من أبي وكذلك البرامج النصية أوديلاي أن تتكيف بسهولة لأنظمة مختلفة والفحوصات التجريبية.
في حين تم تطوير أوديلاي أصلا للخميرة، وكنا قادرين على الاستفادة من ذلك دون تعديل لمراقبة نمو المتفطرة سميغماتيس . مراقبة المستعمرة الأخرى التي تشكل الكائنات الحية الدقيقة هوممكن مع التعديلات على شفرة المصدر المقدمة 11 . بشكل عام، أوديلاي هو أداة قوية ومرنة لمقارنة الكائنات الحية الدقيقة التي تزرع في ظل ظروف بيئية مختلفة واضطرابات وراثية.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يقر المؤلفون بدعم هذا العمل من خلال المنح U54 RR022220 و P50 GM076547 إلى جد من المعاهد الوطنية الأمريكية للصحة. فدم هو زميل ما بعد الدكتوراه مع المعاهد الكندية للبحوث الصحية. كما نشكر مركز لوكسمبورغ للطب الحيوي للنظم وجامعة لوكسمبورغ على الدعم.
Materials
| Agarose UltraPure | ThermoFisher | 16500500 | Gel Temp 36C, Gel Strength (1%) 1.2g/sq cm |
| Yeast Extract Peptone (YEP) | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Complete Suplement Mixture (CSM) | Fisher Scientific | MP114560222 | |
| Polyethylene Glycol 3350 (av. mol. wt. 3000-3700) | SigmaAldrich | P2906 | |
| Yeast Strain BY4741 | ThermoFisher | 95400.BY4741 | |
| Yeast Strain BY4742 | ThermoFisher | 95400.BY4742 | |
| 50mL Falcon tubes | Corning | 430291 | 1 case |
| 15mL Falcon tubes | Corning | 352096 | |
| 2 x 3 inch 1.0mm thick slides 1/2 gross | VWR | 48382-179 | |
| 96 well plate flat bottom | Corning | 353072 | |
| Hydra liquid handleing robot | Thermo | 1096-DT-100 | |
| Hamilton Microlab Star Liquid Handleing Robot | Hamilton | ||
| hydra 100 mL tips Extended Length DARTS | Thermo | 5527 | |
| Synergy H4 Plate Reader | Biotek | H4MLFAD | |
| Leica DMI6000 B Microscope | Leica | ||
| Leica 10X/0.3NA objective | Leica | 11506289 | |
| Hamamatsu ORCA Flash 4.0 Camera | Hamamatsu | C11440-22CU | |
| MATLAB with image processing tool box | Mathworks | ||
| MicroManager | Open Imaging | https://micro-manager.org/ | |
| ODELAY Microscope Control (MATLAB scripts and GUI) | www.aitchisonlab.comODELAY for Matlab scripts and software | ||
| ODELAY Microscope Chamber | www.aitchisonlab.comODELAY for Mechanincal Drawings | ||
| ODELAY Agar Molds | www.aitchisonlab.comODELAY for mold drawings |
Referencias
- Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van’t Riet, K. Modeling of the bacterial growth curve. Appl Environ Microbiol. 56 (6), 1875-1881 (1990).
- Sellick, C. A., Campbell, R. N., Reece, R. J. Galactose metabolism in yeast-structure and regulation of the leloir pathway enzymes and the genes encoding them. Int Rev Cell Mol Biol. 269, 111-150 (2008).
- Yoshikawa, K., et al. Comprehensive phenotypic analysis for identification of genes affecting growth under ethanol stress in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res. 9 (1), 32-44 (2009).
- Bryan, A. K., Goranov, A., Amon, A., Manalis, S. R. Measurement of mass, density, and volume during the cell cycle of yeast. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (3), 999-1004 (2010).
- Baryshnikova, A., et al. Quantitative analysis of fitness and genetic interactions in yeast on a genome scale. Nat Methods. 7 (12), 1017-1024 (2010).
- Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327 (5964), 425-431 (2010).
- Collins, S. R., et al. Functional dissection of protein complexes involved in yeast chromosome biology using a genetic interaction map. Nature. 446 (7137), 806-810 (2007).
- Zackrisson, M., et al. Scan-o-matic: High-Resolution Microbial Phenomics at a Massive Scale. G3 (Bethesda). 6 (9), 3003-3014 (2016).
- Bean, G. J., Jaeger, P. A., Bahr, S., Ideker, T. Development of ultra-high-density screening tools for microbial ‘omics’. PloS One. 9 (1), e85177 (2014).
- Levy, S. F., Ziv, N., Siegal, M. L. Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant. PLoS Biol. 10 (5), e1001325 (2012).
- Herricks, T., et al. One-Cell Doubling Evaluation by Living Arrays of Yeast. ODELAY! G3 (Bethesda). 7 (1), 279-288 (2017).
- Mast, F. D., Ratushny, A. V., Aitchison, J. D. Systems cell biology. J Cell Biol. 206 (6), 695-706 (2014).
- Edelstein, A. D., et al. Advanced methods of microscope control using µManager software. J Biol Methods. 1 (2), e10 (2014).
