ODELAY：用于酵母生长多参数定量的大规模方法

琼脂糖凝胶库的制备称量2 g高纯度琼脂糖。 将琼脂糖加入500 mL瓶中，并记录其合并质量。 用150克超纯水计算瓶子的目标质量和2克琼脂糖，然后加入150克超纯水至该目标物质的0.1克内。 注意瓶子的质量加上琼脂糖和水。 将瓶子放入微波炉中，确保将顶盖上的松散盖子装入瓶子，以尽量减少水分蒸发，同时加热琼脂糖。 微波瓶子在15 – 20秒之间爆发，然后短暂地旋转瓶子来混合琼脂糖和水。重复此过程直到溶液沸腾并且混合物是均匀的。 小心：注意避免烫伤皮肤，避免蒸汽从瓶中逸出。此外，瓶子会变得很热，需要适当的保护，如高压灭菌手套，以避免受伤。在熔融的琼脂糖均匀后，再次称重瓶子，并将超纯水加入原始质量的0.1克内。这将取代由于蒸发而损失的任何水分。 在熔融的琼脂糖凝固之前，旋转以在加入的水中混合以确保均匀性。 将15.2g琼脂糖等分成9-50mL塑料管。 冷却管直到需要。 准备ODELAY琼脂糖介质加热400毫升去离子水，在一个盖烧杯中煮沸，在电热板上用一个磁力搅拌棒轻轻搅拌。 在步骤1.10的50mL锥形管中加入2mL 10X培养基（ 例如酵母提取物胨（YEP）或Complete Supplement Mixture（CSM））至15.2g琼脂糖等分试样。 注意：CSM介质倾向于粘贴玻璃片。如果使用CSM培养基配方，在无菌水中加入5μL50％wt聚乙二醇（PEG）至培养基制剂。 PEG防止agar在脱模期间粘附到玻片上，并且不抑制酵母生长。 如果需要，添加额外的100X营养补充剂，并使用水将总添加量从该步骤提升到1 mL。 在将50mL锥形管置于步骤2.1的沸水中之前，称量琼脂糖等分试样加入培养基和补充剂。 16分钟后，取出50mL管，并用涡旋匀浆混合物。将盖子紧紧地紧固在50mL锥形管上。 注意：烧杯上的盖子有助于均匀加热整个管，否则会形成固体琼脂糖膜，也可能不熔化。此外，在此期间，组装琼脂糖模具是方便的（ 图1 ）。 使用涡流使混合物均质化。 煮沸另外2分钟，以确保所有琼脂混合和融化。 称重管，并用超纯无菌水代替任何损失的物质。 加入2 mL 10X碳酸ce试剂（ 例如 ，20％w / v葡萄糖）并涡旋以获得琼脂糖培养基溶液。 注意：玻璃滑块的分离：组装模具时，必须注意确保长的垫片以正确的方向放置在模具中。这是因为当激光切割丙烯酸时，它倾向于作为锥体切割，离开具有稍微倾斜的侧面的部分而不是恰好90°的侧面。然后当模具放置在台面上以从琼脂中释放玻璃时，间隔物的边缘应与琼脂成锐角。当模具间隔件的外边缘围绕下边缘枢转时，锐角有助于压缩琼脂的边缘远离上部玻璃板（ 见图1 ）。结果是琼脂与顶部玻璃片的分离更为一致。 注意：不要使用应用于玻璃的脱模剂，如油，硅喷雾剂甚至商业窗户处理，因为它们会污染s琼脂的表面，可能抑制生长。这些方法采取一些做法是一致的。 用70％乙醇清洗x 1 mm厚的玻璃载玻片中的4个2×2，并用强制空气干燥。 用70％乙醇清洁丙烯酸模具，干燥并组装， 如图1所示。如图所示，拿起三个底部的零件，并组装它们，使两个相同的零件夹在第三个零件上（ 图1B ）。使用两个小夹子夹紧每侧的基片（ 图1C ）。将立柱放入模具中，确保激光切口正确定位（ 图1E ）。 将清洁干燥的玻璃滑块放在模具上，并将其固定在另一侧。用较大的夹子夹紧组件（ 图1D ）。用较大的活页夹夹住两张幻灯片（lass =“xfig”>图1D）。确保上粘结夹与玻璃滑块重叠与丙烯酸接触。 添加剩余的剪贴簿夹。再次，确保夹具接触与丙烯酸重叠的滑块（ 图1D ）。 注意：在用熔融琼脂填充组装的模具之前，通过沿着模具内侧吸取约70μL的熔融琼脂介质来确保边缘被密封。这种琼脂将迅速凝固并防止任何泄漏。 用熔融琼脂填充模具，确保避免在模具中捕获气泡。 注意：这可以通过沿着模具边缘慢慢吸取熔融琼脂来实现。填充后，允许模具在约23°C环境温度下冷却40分钟至1小时。如果允许冷却太久，琼脂可能在模具中断裂。 注意：模具分离：从浇注琼脂中正确移除模具对于确保均匀的固体至关重要琼脂垫用于酵母生长。不能确保在该步骤中模具的有效分离将导致由于固体琼脂垫中的缺陷而引起的生长差异。推荐几步练习。 从底部夹子夹取下来。拆下由三个夹片组成的模具的底部。压缩幻灯片，然后取下夹子夹。拆卸夹子时，请勿碰到模具侧面。这会使媒体变形。 将模具放在台面的边缘，以使具有蓝点的模具侧面朝上，并在左下角（ 图1E ）。将拇指放在丙烯酸酯的下方，将第一根手指放在模具的内边缘上。 慢慢地，小心地用拇指向上推动模具，好像将模具隔片围绕其下边缘旋转（ 图1F ）。应用常数但缓慢增加的压力。用户将看到一个断裂，气泡出现在顶部玻璃覆盖模具间隔物的线上。 看完初始断线后，继续用拇指向上推，施加恒压。此时琼脂应该从玻璃开始脱落（ 图1F ）。继续向上枢转模具。这样可以提起玻璃而不会滑动玻璃。琼脂从玻璃上剥离的线应该继续离开初始断裂线。 注意：此时，琼脂粘在玻璃的底部和顶部。这将偶尔会发生在最左边缘。只要变形区域不在发现酵母的地方，这应该是罚款。 当玻璃完全自由时，抓住它并将其完全从模具中取出。然后使用类似的动作取出另一个模具，以便不移动琼脂来提升碎片。将幻灯片放在无菌尖端盒底部有一些无菌高纯度水。关闭盒子并储存在4°CO / N，以备第二天使用。如果储存更长时间，增长率将变得不一致。 ODELAY文化准备将菌株置于96孔板中进行O / N生长。 第二天，将20μL的过夜培养物稀释到200μL的培养基中，在一个新的板中达到220μL的总体积。 在平板阅读器中测量每种培养物的600nm（OD600）的光密度。使用读板机和液体处理机器人，遵循步骤3.3.1 – 3.3.6的自动稀释方案。将板中的培养物手动稀释至约0.1 OD600（可选）。 在读板器上，点击“创新”下的“实验”。选择ODELAYDilution.exp并运行实验。输入实验名称为ODELAY“日期”“时间”“实验名称”迭代。 点击s纹身选项卡，然后单击Excel图标。将数据保存到拇指驱动器，并将其传输到液体处理机器人计算机。 打开机器人的布局和方法编辑器。打开方法文件“ODELAYDilution_v1.med”。运行可执行文件“Convert_SynergyFiles.exe”。为目标OD600输入0.09。 点击“Glu校正”和“Gal校正”为0.05。测量相同板材中的空白介质。点击“生成文件”。在方法编辑器中选择文件。点击停车图标启动打开运行时间稀释程序的方法。 确保管子未封盖，并且移除板盖，并从顶端除去防尘盖。装载板，管和尖端到液体处理机器人的甲板上，如甲板布局所示。 点击“播放”按钮运行稀释程序。选择正确数量的50μL提示。选择正确数量的300μL提示。等等12分钟进行运行。 从机器人取稀释板，盖上尖端，并回顾15 mL介质管。在30℃培养板5-6小时。 开始第二次稀释前约1-2小时，请务必打开显微镜的孵育室。允许它们在℃或实验所需的温度下平衡。 重复稀释步骤3.3 – 3.4，但将培养物稀释至0.01至0.02的OD 600，以便在琼脂糖载玻片上观察培养物。 用金属冷冻密封盖住稀释板。 使用离心机金属桶配件将稀释板在冰浴中超声处理30秒，使板悬浮在冰水中，以固定板（ 图2A ）。将超声处理的培养物从稀释板转移到平底板。标记4×96孔平底板1,2,3和4（ 图2B ）。 转让150＆＃181;将来自孔A01-D06的稀释板的L加入标记为1的板的孔C04-F09中。然后将150μL稀释板从孔A07-D12转移到标记为2的板的孔C04-F09中。然后转移150μL将孔E01-H06的稀释板放入标记为3的板的C04-F09孔中。最后将150μL的稀释板从孔E07-H12转移到标有4的板的C04-F09孔中。 转到步骤4，点燃琼脂。 4.使用自动液体检测机器人检测琼脂从其加湿的无菌吸管盒中取出以4°CO / N（来自步骤2.19）储存的琼脂糖载玻片。 如果需要，用干净的剃刀刀片修剪琼脂糖培养基的角落，以确保它们适合滑动室。 从支架上卸下滑块。小心地将琼脂板放入舞台室底座的凹陷区域。 注意：确保或幻灯片的方法从实验到实验是一致的。 检查以确保夹具与腔室底部齐平。如果弯曲，则幻灯片可能未完全就位在凹进的区域。将调平间隔件放入点样机器人的中心板位置。该间隔件为调平螺钉提供接触，使得滑动室可以与尖端平齐。 将板放在桌子上，按照它们的象限。板1，2，3和4从左到右排列（ 图2B ）。 布置提示，使内部24口井C04 – F09被占用4个空的提示盒。第五个盒子需要有一个尖端在C10位置，以及4个尖端，其端点在A01，A12，H01和H12位置被切断。这4个切断尖端为尖端板夹具提供了稳定性（ 图2C 和2D ）。 从sl上卸下顶盖ide室安装。 将第一个尖头冲头放入机器人控制点测试程序的起始位置。这应该在琼脂糖上打孔，以后将用于对齐原点坐标。将液位处理机器人上的板1放在第一象限位置。确保盖子已拆除，并继续检测程序。 检查以确保所有斑点都存在。另外，等待〜30秒，让他们干燥。当斑点直径约为1mm时，程序可能会继续。将用过的尖端清空到生物危害容器中，并将新鲜的提示放在机器人上。换出第2象限盘1。 重复第三个象限。并重复第四个象限。 当斑点干燥时，更换滑盖室盖并翻转设备。 用空气过滤器安装管路连接。 将玻璃滑块放在腔室的顶部。 注意：此幻灯片对于reduci至关重要将热通量传递到琼脂中，并使冷凝物形成在室的客体盖滑动侧。不要忘记这个封面。根据显微镜结构，该盖滑动防止来自照明侧的加热在物体侧引起冷凝。 放置风扇将热空气吹到室的物体侧。该风扇防止在盖板上形成冷凝。将通过起泡器的空气流量设定为10mL / min。 5.在显微镜上运行ODELAY 运行脚本“ODELAY_Microscope_Control.m”。 点击“快门”打开传输的光快门，然后点击“对焦”按钮启动高相机速率（ 图3A ，红色箭头）。 点击“去原点”，移动舞台，找到在琼脂中冲孔的原点。 然后向右移动专注于区域E07发现的酵母细胞。 返回到原点打孔并将其居中在视野中。 通过按“设置”按钮（ 图3A ，蓝色箭头）将原点设置为该值。现在移动到位置H18并使用最靠近该位置的六角螺丝进行对焦。然后移动到位置L07并使用最靠近该位置的六角螺丝进行对焦。然后移动到位置E07并使用距离该位置最近的六角螺丝进行对焦。 根据需要重复步骤5.5 – 5.7，直到这些位置保持对焦。 检查中心的焦点和位于E12，H12，L12处的边缘。如果由Z值表示的焦点Z值大于±自动对焦范围（ 例如 ，将自动对焦范围设置为60μm，中心点的Z值大于±），则调整自动对焦范围40μm）。 按复位按钮，这将激活按钮属性，然后按ODELAY（ 图3A ，绿色箭头）。选择保存数据的目录。确保有足够的驱动器空间可用。 注意：显微镜收集数据48小时，或直到程序关闭。 6.处理ODELAY数据打开ODELAY_IPT.exe或使用脚本ODELAY_Image_Processing_Tool_v7.m脚本（ 图3C ）。 准备一个* ODELAYExpDisc.xlsx excel电子表格。 在单元格B1中命名实验。 选择存储图像文件E07 – H18的图像目录。 选择要写入数据的数据目录。 将实验开始的日期写入单元格B04。使用格式MM / DD / YYYY。 在C04单元中写入稀释时间。这个时间大约是在收集第一张图像之前的五分钟。使用格式HH：MMpm，其中HH为h，MM为最小。 根据t加入菌株名称o源板（步骤3.1）。由于菌株被发现的方式，它们被重新排列在ODELAY琼脂糖载玻片上。电子表格B31-B126中的单元是源极板，而细胞C31 – C126是ODELAY琼脂平板中的斑点位置。 然后按“过程数据”按钮，然后选择刚准备好的* ODELAYExpDisc.xlsx。 根据用于处理数据的计算机系统等待16-24小时。 处理图像时，会出现名为“ODELAY Well Data”的目录和文件“* _Index_ODELAYData.mat”。按“加载数据”按钮，选择刚生成的“* _Index_ODELAYData.mat”文件。这将加载刚刚处理的数据集。文件名中的“*”将根据输入到excel电子表格中的实验名称进行列出。 加载数据后，使用底部找到的时间栏进行检查，点击图像正方形以查看生长曲线f或那个地点，或在左边的列表中找到一个很好的兴趣，然后加载该列表的图像。 按“小提琴图”按钮生成人口增长参数的直方图。这将产生如图4或图6所示的曲线。