ODELAY: крупномасштабный метод многопараметрического количественного определения роста дрожжей

1. Приготовление запаса геля агарозы Взвесьте 2 г агарозы высокой чистоты. Добавить агарозу в бутылку объемом 500 мл и записать их комбинированную массу. Рассчитайте целевую массу бутылки плюс 2 г агарозы с 150 г ультрачистой воды, затем добавьте 150 г ультрачистой воды до 0,1 г этой целевой массы. Обратите внимание на массу бутылки плюс агарозу и воду. Поместите бутылку в микроволновую печь и убедитесь, что она установлена ​​в бутылке с крышкой сверху, чтобы минимизировать испарение воды при нагревании агарозы. Микроволновую бутылку через 15-20 с, а затем кратковременно закручивали бутылку для смешивания агарозы и воды. Повторите эту процедуру до тех пор, пока раствор не кипит, и смесь будет однородной. ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Соблюдайте осторожность, чтобы избежать ошпаривания кожи с вытеканием пара из бутылки. Кроме того, бутылка станет горячей на ощупь, и для предотвращения травм необходима соответствующая защита, например, автоклавная перчатка. После того, как расплавленная агароза будет однородной, снова взвесьте бутылку и добавьте сверхчистую воду с точностью до 0,1 г исходной массы. Это заменит любую потерю воды из-за испарения. Перед тем, как расплавленная агароза затвердеет, закрутите, чтобы перемешать в добавленной воде, чтобы обеспечить однородность. Аликвоту 15,2 г агарозы в 9 – 50 мл пластиковых труб. Охлаждайте трубки до тех пор, пока они не понадобятся. 2. Подготовка ODELAY Agarose Media Нагреть 400 мл деионизированной воды, чтобы кипятить в закрытом стакане, на плите при осторожном перемешивании с помощью магнитной мешалки. Добавить 2 мл 10X среды ( например , дрожжевого экстракта Пептона (YEP) или полную добавочную смесь (CSM)) в аликвоту агарозы 15,2 г в конической трубке 50 мл с этапа 1.10. ПРИМЕЧАНИЕ. Среда CSM имеет тенденцию придерживаться стеклянных слайдов. При использовании композиций среды CSM добавьте 5 мкл 50% мас. Полиэтиленгликоля (ПЭГ) в стерильной воде к препарату средней массы. ПЭГ предотвращаетGar от прилипания к стеклянным слайдам во время освобождения плесени и не препятствует росту дрожжей. Добавьте дополнительные 100X питательные добавки, если необходимо, и используйте воду, чтобы довести общий добавленный объем с этого шага до 1 мл. Взвесьте агарозную аликвоту с добавкой среды и добавок перед тем, как поместить 50 мл коническую трубку в кипящую воду со стадии 2.1. Через 16 минут выньте 50 мл пробирку и гомогенизируйте смесь, используя вихрь. Держите колпачок плотно закрепленным на конической трубке 50 мл. ПРИМЕЧАНИЕ. Крышка на стакане равномерно нагревает всю трубку, иначе пленка из твердой агарозы будет образовываться и, возможно, не таять. Также в это время удобно собирать агарозную форму ( рис. 1 ). Гомогенизируйте смесь, используя вихрь. Кипятите еще 2 мин, чтобы весь агар был смешан и расплавлен. Взвесьте трубку и замените любую потерю массы ультрачистой стерильной водой. Добавить 2 мл 10-кратного углекислотного( Например , 20% мас. / Об. Глюкозы) и вихря для получения раствора агарозной среды. ПРИМЕЧАНИЕ. Разделение стеклянных слайдов: при сборке пресс-формы необходимо следить за тем, чтобы длинные распорки были помещены в форму с правильной ориентацией. Это связано с тем, что, когда лазер разрезает акрил, он имеет тенденцию резать, когда конус оставляет часть со слегка угловыми сторонами, а не ровно на 90 °. Затем, когда форму помещают на столешницу для выпуска стекла из агара, край прокладки должен быть под острым углом с агаром. Острый угол помогает сжать край агара от верхней части стекла, поскольку внешний край разделителя формы поворачивается вокруг нижней кромки (см. Рисунок 1 ). В результате получается более последовательное отделение агара от верхней части стекла. ПРИМЕЧАНИЕ. Средства для выпуска пресс-форм, применяемые к стеклу, такие как масла, кремниевые спреи или даже коммерческие обработки окон, не должны использоваться, поскольку они загрязняют Urface агара и, возможно, ингибирует рост. Эти методы требуют определенной практики. Очистите четыре стеклянных слайда толщиной 2 х 3 дюйма х 1 мм с 70% этанолом и высушите их с помощью принудительного воздуха. Очистите акриловые формы с 70% этанолом, высушите и собрайте, как показано на рисунке 1 . Возьмите три нижних куска, как показано на рисунке, и соберите их так, чтобы две одинаковые части сэндвич с третьей частью ( рис. 1B ). Закрепите части основания на каждой стороне двумя маленькими скобками ( рис. 1C ). Поместите стойки в пресс-форму, убедившись, что лазерный керф правильно расположен ( рис. 1E ). Поместите очищенный и высушенный стеклянный предмет на пресс-форму и удерживайте его на месте, помещая второй стеклянный предмет на другую сторону. Закрепите узел с помощью более крупного связующего ( рис. 1D ). Зажмите обе слайды с помощью более крупных зажимов для связующих (Lass = "xfig"> Рисунок 1D). Убедитесь, что верхний связующий зажим находится в контакте с стеклянным слайдом, перекрывающимся акрилом. Добавьте оставшиеся связующие зажимы. Опять же, убедитесь, что зажимы касаются слайда, где он перекрывает акрил ( рисунок 1D ). ПРИМЕЧАНИЕ. Перед заполнением собранной формы расплавленным агаром убедитесь, что края герметизированы путем пипетирования около 70 мкл расплавленной агаровой среды вдоль внутренней стороны формы. Этот агар быстро затвердевает и предотвращает любые утечки. Заполните пресс-форму расплавленным агаром, следя за тем, чтобы избежать попадания пузырьков воздуха в пресс-форму. ПРИМЕЧАНИЕ. Это может быть достигнуто путем медленной пипетирования расплавленного агара вдоль края формы. После того, как он будет заполнен, дайте пресс-форме остыть в течение 40 минут до 1 часа при температуре окружающей среды около 23 ° C. Если позволено слишком быстро охладиться, агар может переломиться в пресс-форме. ПРИМЕЧАНИЕ. Разделение пресс-формы. Правильное удаление формы из литого агара имеет важное значение для обеспечения однородного твердогоАгар для роста дрожжей. Неспособность обеспечить эффективное разделение формы на этой стадии приведет к различиям в росте, которые могут быть связаны с несовершенствами в твердой агаровой подушке. Рекомендуется применять этот шаг несколько раз. Начните с удаления нижнего связующего. Снимите нижнюю часть пресс-формы, которая состоит из трех зажатых кусков. Держите слайды, сжимая их, а затем удалите зажимы связующего. Обязательно не ударяйте стороны формы при удалении связующих зажимов. Это приведет к деформированию носителя. Поместите пресс-форму на край скамьи, чтобы сторона формы с синей точкой была направлена ​​вверх и в левом нижнем углу ( рис. 1Е ). Поместите пальцы под акрилом и первым пальцем сверху к внутреннему краю формы. Медленно и осторожно надавливайте большим пальцем на плесень, как бы поворачивая распорку пресс-формы вокруг ее нижнего края ( рис. 1F ). Применить константуНо медленно увеличивая давление. У пользователей появится разрыв и воздушный пузырь, появляющийся вдоль линии, где верхнее стекло покрывает прокладку пресс-формы. Увидев начальную линию прерывания, продолжайте подталкивать пальцами и применяйте постоянное давление. Агар должен начать отрываться от стекла в этот момент ( рис. 1F ). Продолжайте поворачивать форму вверх. Это поднимет стекло, не сдвигая его. Линия, где агар отслаивается от стекла, должен продолжать отходить от начальной линии разлома. ПРИМЕЧАНИЕ. В этот момент агар прилипает к нижней и верхней части стекла. Это будет происходить с самым левым краем. Пока область деформирована не в области, где дрожжи замечены, это должно быть хорошо. Когда стекло полностью освободится, возьмите его и полностью удалите из формы. Затем удалите другую часть пресс-формы, используя аналогичное движение, чтобы снять кусочек без перемещения агара. Поместите слайды вСтерильный ящик для чашек с некоторой стерильной водой высокой чистоты в нижней части. Закройте коробку и храните ее при 4 ° CO / N для использования на следующий день. Если хранить дольше, темпы роста станут непоследовательными. 3. Подготовка культуры ODELAY Выложите штаммы в 96-луночный планшет для роста O / N. На следующий день разведите 20 мкл ночной культуры в 200 мкл среды для общего объема 220 мкл в новой пластине. Измерьте оптическую плотность при 600 нм (OD600) каждой культуры в планшетном ридере. Используя устройство для считывания пластин и робот для обработки жидкости, следуйте автоматизированному протоколу разбавления по этапам 3.3.1 – 3.3.6. Вручную разбавьте культуры в пластине примерно до 0,1 OD600 (необязательно). На планшетном ривере нажмите «Эксперимент» в разделе «Создать новое». Выберите ODELAYDilution.exp и запустите эксперимент. Введите название эксперимента в качестве ODELAY «Дата» «Время» «Имена экспериментов». Нажмите на sTatistics, а затем щелкните значок Excel. Сохраните данные на флэш-накопитель и перенесите их на компьютер робота для обработки жидкости. Откройте редактор макета робота и редактор методов. Откройте файл метода «ODELAYDilution_v1.med». Запустите исполняемый файл «Convert_SynergyFiles.exe». Введите 0.09 для целевого OD600. Нажмите «Коррекция глюка» и «Гал-коррекция» до 0,05. Измерьте заготовку в идентичной пластине. Нажмите «Создать файл». Выберите файл в редакторе методов. Нажмите на значок стоп-сигнала, чтобы запустить метод, чтобы открыть программу разбавления времени выполнения. Удостоверяются, что трубки не открываются, а пластины имеют крышки, и пылезащитные крышки удаляются с наконечников. Загрузите пластины, трубки и наконечники на палубу робота для обработки жидкости, как указано в расположении колоды. Нажмите кнопку «Воспроизвести», чтобы запустить программу разбавления. Выберите правильное количество советов по 50 мкл. Выберите правильное количество 300 мкл. Подождите12 минут для запуска процесса. Возьмите пластину для разбавления от робота, закройте наконечники и повторите 15-миллилитровые пробирки. Культивируйте планшет в течение 5-6 часов при температуре 30 ° C. Примерно за 1 – 2 часа перед началом второго разбавления обязательно включите инкубационные камеры для микроскопа. Позвольте им уравновешиваться при ° C или температуре, требуемой для эксперимента. Повторите шаги разбавления 3,3-3,4, но разбавьте культуры до OD600 0,01-0,02 для определения культур на агарозных слайдах. Накройте пластину для разбавления металлическим уплотнением морозильной камеры. Сонатрите разбавляющую пластину на ледяной бане в течение 30 с с пластиной, плавающей в ледяной воде, с помощью центрифужного металлического ковшового фитинга, чтобы удерживать пластину ( рис. 2А ). Перенесите обработанные ультразвуком культуры с пластины для разбавления на плоскую нижнюю пластину. Этикетка 4 x 96-луночные плоские нижние пластины 1, 2, 3 и 4 ( рисунок 2B ). Трансфер 150 &№ 181; L разрезной пластины из лунок A01 – D06 в лунки C04 – F09 пластины, помеченной 1. Затем переместите 150 мкл разбавляющей пластины из лунок A07 – D12 в лунки C04 – F09 пластины, помеченной 2. Затем переместите 150 мкл Разбавляющей пластины из колодцев E01 – H06 в лунки C04 – F09 пластины, помеченной 3. Наконец, переносите 150 мкл разбавляющей пластины из колодцев E07 – H12 в лунки C04 – F09 пластины, помеченной 4. Перейдите к шагу 4, «Пятно на агаре». 4. Пятнистость на агаре с использованием автоматизированного робота для определения пятен Удалите агарозные слайды, хранящиеся при 4 ° СО / Н (с шага 2.19) из их увлажненных стерильных ящиков для пипеток. При необходимости отрежьте углы агарозной среды чистым лезвием бритвы, чтобы они поместились в камеру скольжения. Снимите скобу с крепления. Осторожно поместите пластину агара в углубленную область крепления камеры. ПРИМЕЧАНИЕ. Убедитесь, чтоУстойчивость слайда согласуется с экспериментом и экспериментом. Убедитесь, что зажим заподлицо с нижней частью камеры. Если он криволинейный, то ползунок может не полностью усаживаться в углубленной области. Поместите выравнивательную прокладку в положение центральной пластины робота-пятнистости. Эта распорка обеспечивает контакт для выравнивающих винтов, так что ползунок можно выровнять с помощью наконечников. Поместите пластины на стол в порядке их квадранта. Плиты 1, 2, 3 и 4 упорядочены слева направо ( рис. 2B ). Выложите наконечники так, чтобы внутренние 24 лунки C04 – F09 были заняты кончиками в 4 пустых наконечника. Пятый ящик должен иметь один наконечник в положении C10, а также 4 кончика с обрезанными концами в положениях A01, A12, H01 и H12. Эти четыре срезанных наконечника обеспечивают стабильность зажимного наконечника ( рис. 2C и 2D ). Снимите верхнюю крышку со слотаОбразная камера. Поместите первый наконечник наконечника в начальный участок программы обнаружения робота. Это должно пробить отверстие в агарозе, которое позже будет использоваться для выравнивания координат начала координат. Поместите пластину 1 на робот для обработки жидкости, чтобы определить первый квадрант. Убедитесь, что крышка снята и продолжите программу определения пятен. Убедитесь, что все пятна присутствуют. Кроме того, подождите ~ 30 с, чтобы они высохли. Когда пятна имеют диаметр около 1 мм, программа может продолжаться. Опорожните использованные наконечники в контейнере с биологической опасностью и поместите свежие наконечники на робот. Замените пластину 1 для пластины 2- го квадранта. Повторите для третьего квадранта. Повторите еще раз для 4- го квадранта. Когда пятна сухие, замените крышку камеры скольжения и переверните аппарат. Установите трубные соединения с воздушным фильтром. Поместите стеклянный предмет на верхнюю сторону камеры. ПРИМЕЧАНИЕ. Этот слайд имеет решающее значение для сокращенияПоток тепла к агару и минимизирует образование конденсата на стороне скольжения объектива. Не забывайте об этом обложке. В зависимости от конфигурации микроскопа этот прокол крышки предотвращает нагрев со стороны освещения от конденсации на стороне объектива. Установите вентилятор, чтобы нагреть горячий воздух на объектив. Этот вентилятор предотвращает образование конденсата на крышке. Установите расход воздуха через барботер до 10 мл / мин. 5. Запуск ODELAY на микроскопе Запустите скрипт «ODELAY_Microscope_Control.m». Нажмите «Затвор», чтобы открыть передаваемый световой затвор, а затем кнопку «Фокус», чтобы начать высокую скорость камеры ( рис. 3А , «Красные стрелки»). Нажмите «Go Origin» и переместите сцену, чтобы найти отметку начала, которая была пробита в агаре. Затем слегка двигайтесь вправоСосредоточиться на дрожжевых клетках, замеченных в области E07. Вернитесь к началу координат и центрируйте его в поле зрения. Установите значение источника в это значение, нажав кнопку «set» ( Рисунок 3A , «Синие стрелки»). Теперь переместитесь в позицию H18 и сфокусируйтесь с помощью шестигранного винта, ближайшего к этому месту. Затем переместитесь в положение L07 и сфокусируйтесь с помощью шестигранного винта, ближайшего к этому месту. Затем переместитесь в положение E07 и сфокусируйтесь с помощью шестигранного винта, ближайшего к этому месту. Повторяйте шаги 5.5 – 5.7 по мере необходимости, пока эти позиции не останутся в фокусе. Проверьте фокусировку в центре и по краям в местах E12, H12, L12. Отрегулируйте диапазон автофокусировки, если значения Z-фокуса, указанные в значении Z, превышают ± диапазон автофокуса ( например , установите диапазон автофокусировки на 60 мкм Z-значение для центрального пятна, которое больше, чем ± 40 мкм). Нажмите кнопку сброса, так как это активирует свойства кнопки, а затем нажмитеODELAY ( Рисунок 3A , Зеленые стрелки). Выберите каталог для сохранения данных. Убедитесь, что достаточно места на диске. ПРИМЕЧАНИЕ. Микроскоп собирает данные в течение 48 часов или пока программа не будет закрыта. 6. Обработка данных ODELAY Откройте ODELAY_IPT.exe или используйте скрипт ODELAY_Image_Processing_Tool_v7.m ( рисунок 3C ). Подготовьте * ODELAYExpDisc.xlsx таблицу Excel. Назовите эксперимент в ячейке B1. Выберите каталог изображений, в котором хранятся файлы изображений E07 ​​- H18. Выберите каталог данных, в котором будут записываться данные. Напишите дату начала эксперимента в ячейку B04. Используйте формат MM / DD / YYYY. Напишите время разведения в ячейке C04. Это время составляет примерно пять минут до того, как будет собрано первое изображение. Используйте формат HH: MMpm, где HH для h, а MM – мин. Добавить в названиях деформаций по tO исходная пластина (шаг 3.1). Из-за того, что штаммы замечены, они перегруппированы на агарозном слайде ODELAY. Клетки в таблице B31-B126 являются исходной пластинкой, а ячейки C31 – C126 – пятнами в пластине агара ODELAY. Затем нажмите кнопку «Данные процесса» и выберите * ODELAYExpDisc.xlsx, который был только что подготовлен. Подождите 16-24 часов в зависимости от компьютерной системы, используемой для обработки данных. Когда изображения будут обработаны, появится каталог с именем «ODELAY Well Data» и файл «* _Index_ODELAYData.mat». Нажмите кнопку «Загрузить данные» и выберите только что созданный файл «* _Index_ODELAYData.mat». Это загрузит набор данных, который был только что обработан. «*» В имени файла будет указан в соответствии с именем эксперимента, введенным в таблицу Excel. После загрузки данных проверьте его, используя временную шкалу, найденную в нижней части, щелкните квадрат изображения, чтобы увидеть кривые роста fИли это место, или найдите интерес, который интересен в списке слева, а затем загрузите изображения для этого списка. Создайте гистограммы параметров роста населения, нажав кнопку «Скрипка». Это создаст график, показанный на рисунке 4 или на рисунке 6 .