ODELAY: Eine groß angelegte Methode für die Mehrparameter-Quantifizierung des Hefewachstums

1. Vorbereitung der Agarose Gel Stock 2 g hochreine Agarose abwiegen. Füge die Agarose zu einer 500 ml Flasche hinzu und notiere ihre kombinierte Masse. Berechnen Sie die Zielmasse der Flasche plus 2 g Agarose mit 150 g ultrareinem Wasser und fügen Sie dann 150 g ultrareines Wasser innerhalb von 0,1 g dieser Zielmasse hinzu. Beachten Sie die Masse der Flasche plus die Agarose und Wasser. Legen Sie die Flasche in eine Mikrowelle und achten Sie darauf, die Flasche mit einer losen Kappe auf die Oberseite zu passen, um die Wasserverdampfung beim Erwärmen der Agarose zu minimieren. Mikrowelle die Flasche in 15 – 20 s Bursts gefolgt von kurz wirbeln die Flasche, um die Agarose und Wasser zu mischen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die Lösung kocht und die Mischung homogen ist. ACHTUNG: Achten Sie darauf, dass die Haut mit Dampf aus der Flasche entweicht. Auch wird die Flasche heiß an die Berührung und ein geeigneter Schutz, wie ein Autoklavenhandschuh, ist erforderlich, um Verletzungen zu vermeiden. Nachdem die geschmolzene Agarose homogen ist, wiegt sie die Flasche wieder und fügt innerhalb von 0,1 g der ursprünglichen Masse hochreines Wasser hinzu. Dadurch wird das durch Verdunstung verlorene Wasser ersetzt. Bevor die geschmolzene Agarose erstarrt, wirbeln, um das Zusatzwasser zu mischen, um eine Homogenität zu gewährleisten. Aliquot 15,2 g Agarose in 9 – 50 ml Plastikröhrchen. Die Röhrchen bis zum Anbau kühlen. 2. Vorbereitung von ODELAY Agarose-Medien Man erhitze 400 ml entionisiertes Wasser, um in einem überdachten Becher zu kochen, auf einer Kochplatte unter leichtem Rühren mit einem Magnetrührstab. Füge 2 ml 10X-Medium ( z . B. Hefeextrakt Pepton (YEP) oder Komplement Ergänzungsmischung (CSM) zu einem 15,2 g Agarosealiquot in einem 50 ml konischen Röhrchen aus Schritt 1.10 hinzu. HINWEIS: CSM-Medium neigt dazu, an den Glasrutschen zu haften. Bei Verwendung von CSM-Medienformulierungen werden 5 μl 50% iges Polyethylenglykol (PEG) in steriles Wasser der Mediumformulierung zugesetzt. Das PEG verhindert das aGar beim Ankleben an die Glasrutschen während der Formtrennung und hemmt das Hefewachstum nicht. Fügen Sie zusätzliche 100X Nährstoffergänzungen hinzu, falls erforderlich, und verwenden Sie Wasser, um das gesamte hinzugefügte Volumen von diesem Schritt auf 1 ml zu bringen. Wiegen Sie das Agarose-Aliquot mit Zusatzmedien und Ergänzungen, bevor Sie das 50 ml konische Röhrchen aus Schritt 2.1 in kochendes Wasser geben. Nach 16 min das 50 ml Röhrchen herausnehmen und die Mischung mit einem Wirbel homogenisieren. Halten Sie die Kappe fest auf dem 50 mL konischen Rohr befestigt. HINWEIS: Ein Deckel auf dem Becher hilft, das ganze Rohr gleichmäßig zu erwärmen, sonst wird ein Film aus fester Agarose bilden und möglicherweise nicht schmelzen. Auch während dieser Zeit ist es zweckmäßig, die Agaroseform zusammenzubauen ( Abbildung 1 ). Homogenisieren der Mischung unter Verwendung eines Wirbels. Kochen für weitere 2 min, um sicherzustellen, dass alle Agar gemischt und geschmolzen ist. Wiegen Sie Rohr und ersetzen Sie jede Masse verloren mit ultra-reinem sterilen Wasser. Füge 2 ml 10X kohlensäure hinzuCe-Reagenz ( z . B. 20% w / v Glucose) und Vortex, um Agarose-Medium-Lösung zu erhalten. HINWEIS: Trennung von Glasschienen: Beim Zusammenbau der Form ist darauf zu achten, dass die langen Distanzstücke mit der richtigen Ausrichtung in die Form gebracht werden. Dies liegt daran, da der Laser das Acryl schneidet, neigt es dazu, als ein Kegel zu schneiden, der das Teil mit leicht abgewinkelten Seiten anstelle von genau 90 ° Seiten verlässt. Dann, wenn die Form auf die Tischplatte gelegt wird, um das Glas aus dem Agar freizugeben, sollte die Kante des Abstandshalters in einem spitzen Winkel mit dem Agar sein. Der spitze Winkel hilft, die Kante des Agars von dem oberen Glasstück weg zu komprimieren, wenn die Außenkante des Formabstandshalters um die untere Kante geschwenkt wird (siehe Abbildung 1 ). Das Ergebnis ist eine konsistentere Trennung des Agars vom oberen Stück Glas. HINWEIS: Formtrennmittel, die auf das Glas aufgebracht werden, wie Öle, Silikon-Sprays oder sogar kommerzielle Fensterbehandlungen sollten nicht verwendet werden, da sie die s verunreinigen Ursprung des Agars und möglicherweise hemmen das Wachstum. Diese Methoden nehmen einige Praxis, um konsistent zu sein. Reinigen Sie vier 2 in x 3 in x 1 mm dicken Glasrutschen mit 70% Ethanol und trocknen Sie mit Zwangsluft. Saubere Acrylformen mit 70% Ethanol, trocknen und zusammenbauen, wie in Abbildung 1 gezeigt . Nehmen Sie die drei unteren Stücke, wie gezeigt, und montieren Sie sie, so dass die beiden identischen Stücke sandwich das dritte Stück ( Abbildung 1B ). Klemmen Sie die Basisstücke auf jeder Seite mit zwei kleinen Binder-Clips ( Abbildung 1C ). Legen Sie die Ständer in die Form, um sicherzustellen, dass der Laser kerf korrekt positioniert ist ( Abbildung 1E ). Legen Sie den gereinigten und getrockneten Glasschieber auf die Form und halten Sie ihn fest, während Sie einen zweiten Glasschieber auf die andere Seite legen. Klemmen Sie die Baugruppe mit einem größeren Binderclip ( Abbildung 1D ). Klemmen Sie beide Folien mit größeren Binder-Clips (Lass = "xfig"> Abbildung 1D). Vergewissern Sie sich, dass der obere Binderclip mit der Glasscheibe übereinstimmt, die mit dem Acryl überlappt. Hinzufügen von verbleibenden Binder-Clips. Wieder stellen Sie sicher, dass die Klemmen den Schieber berühren, wo er das Acryl überlappt ( Abbildung 1D ). HINWEIS: Bevor Sie die zusammengesetzte Form mit geschmolzenem Agar füllen, stellen Sie sicher, dass die Kanten durch Pipettieren von ca. 70 μl geschmolzenem Agarmedium entlang der Innenseite der Form versiegelt werden. Dieser Agar wird schnell verfestigen und verhindert Lecks. Füllen Sie die Form mit geschmolzenem Agar, um sicherzustellen, dass Sie Luftblasen in der Form einfangen. HINWEIS: Dies kann durch langsames Pipettieren des geschmolzenen Agars am Rand der Form erreicht werden. Nachdem es gefüllt ist, lassen Sie die Form für 40 min bis 1 h bei etwa 23 ° C Umgebungstemperatur abkühlen. Wenn man sich zu lange abkühlen lässt, kann der Agar in der Form brechen. HINWEIS: Formtrennung: Eine ordnungsgemäße Entfernung der Form aus dem gegossenen Agar ist wichtig, um einen gleichmäßigen Feststoff zu gewährleistenAgar-Pad für Hefe-Wachstum. Das Versagen, eine effiziente Trennung der Form bei diesem Schritt zu gewährleisten, führt zu Wachstumsdifferenzen, die auf Unvollkommenheiten in dem festen Agar-Pad zurückzuführen sind. Das Üben dieses Schrittes wird ein paar Mal empfohlen. Beginnen Sie mit dem Entfernen der unteren Binder-Clip. Entfernen Sie den unteren Teil der Form, die aus den drei Sandwich-Stücke besteht. Halten Sie die Folien durch Komprimieren und entfernen Sie dann die Binder-Clips. Achten Sie darauf, dass Sie die Formscheiben nicht stoßen, während Sie die Binder-Clips entfernen. Dadurch werden die Medien verformt. Legen Sie die Form auf den Rand der Tischplatte, so dass die Seite der Form mit dem blauen Punkt nach oben und in der unteren linken Ecke ( Abbildung 1E ). Legen Sie Daumen unter den Acryl und den ersten Finger auf die Oberseite in Richtung der inneren Kante der Form. Langsam und vorsichtig mit Daumen gegen die Form nach oben drücken, als ob der Formabstandhalter um seine Unterkante schwenkbar ist ( Abbildung 1F ). Konstant anwendenAber langsam zunehmender Druck Die Benutzer sehen eine Pause und Luftblase erscheinen entlang der Linie, wo das obere Glas bedeckt die Form spacer. Nachdem du die anfängliche Bruchlinie gesehen hast, gehst du mit Daumen hoch und drückst einen konstanten Druck an. Der Agar sollte an diesem Punkt vom Glas abbrechen ( Abbildung 1F ). Die Form weiter nach oben drehen. Das hebt das Glas an, ohne es zu schieben. Eine Linie, in der sich der Agar vom Glas abzieht, sollte sich von der anfänglichen Bruchlinie entfernen. HINWEIS: An diesem Punkt klebt der Agar sowohl an der Unterseite als auch an der Oberseite des Glases. Dies geschieht gelegentlich mit dem am weitesten links liegenden Rand. Solange die Fläche deformiert ist nicht in der Gegend, wo Hefe entdeckt wird, sollte dies gut sein. Wenn das Glas ganz frei kommt, packen Sie es und entfernen Sie es vollständig aus der Form. Dann entfernen Sie das andere Formteil mit einer ähnlichen Bewegung, um das Stück frei zu heben, ohne den Agar zu bewegen. Legen Sie die Folien in eineSterile Spitzenbox mit etwas sterilem hochreinem Wasser im Boden. Schließen Sie die Schachtel und lag bei 4 ° CO / N für den nächsten Tag. Bei längerer Lagerung werden die Wachstumsraten inkonsistent. 3. ODELAY Kulturvorbereitung Legen Sie Stämme in eine 96-Well-Platte für O / N-Wachstum. Am nächsten Tag verdünnen Sie 20 μl Overnight-Kultur in 200 μL Medium für 220 μl Gesamtvolumen in einer neuen Platte. Messen Sie die optische Dichte bei 600 nm (OD600) jeder Kultur in einem Plattenleser. Mit einem Plattenleser und einem Flüssigkeitshandhabungsroboter folgen Sie dem automatischen Verdünnungsprotokoll der Schritte 3.3.1 – 3.3.6. Manuell verdünnen die Kulturen in der Platte auf ca. 0,1 OD600 (optional). Auf dem Plattenleser traf "Experiment" unter "neu erstellen". Wähle ODELAYDilution.exp und lauf das Experiment. Geben Sie den Namen des Experiments als ODELAY "Datum" "Zeit" "Experimentname" Iteration ein. Klicken Sie auf die sTatistics Tab und klicken Sie dann auf das Excel-Symbol. Sichern Sie die Daten auf einen Daumen-Laufwerk und übertragen Sie es auf einen Flüssigkeits-Handling-Roboter-Computer. Öffnen Sie den Layout- und Methoden-Editor des Roboters. Öffnen Sie die Methodendatei "ODELAYDilution_v1.med". Führen Sie die ausführbare Datei "Convert_SynergyFiles.exe" aus. Geben Sie 0,09 für Ziel-OD600 ein. Klicken Sie auf "Glu Correction" und "Gal Correction" auf 0,05. Messen Sie leere Medien in einer identischen Platte. Klicken Sie auf "Datei generieren". Wählen Sie die Datei im Methodeneditor aus. Klicken Sie auf das Ampel-Symbol, um die Methode zu starten, um das Laufzeit-Verdünnungsprogramm zu öffnen. Vergewissern Sie sich, dass die Rohre nicht verschlossen sind und die Platten mit Deckel versehen sind und die Abdeckungen von den Spitzen entfernt sind. Legen Sie Platten, Rohre und Spitzen auf das Flaschenhandling Roboter Deck, wie durch das Deck-Layout angezeigt. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Play", um das Verdünnungsprogramm auszuführen. Wählen Sie die richtige Anzahl von 50 μl Spitzen. Wählen Sie die richtige Anzahl von 300 μl Spitzen. Warte mal12 min für den laufenden lauf. Nehmen Sie die Verdünnungsplatte vom Roboter, bedecken Sie die Spitzen und rekapitulieren Sie die 15 ml Medienröhrchen. Kultur die Platte für 5 – 6 h bei 30 ° C. Etwa 1 – 2 h vor Beginn der zweiten Verdünnung stellen Sie sicher, dass die Inkubationskammern für das Mikroskop eingeschaltet werden. Lassen Sie sie bei ° C äquilibrieren oder die für den Versuch erforderliche Temperatur. Wiederholen Sie die Verdünnungsschritte 3.3 – 3.4, aber verdünnen Sie die Kulturen auf eine OD600 von 0,01 – 0,02, um die Kulturen auf Agaroseschlitten aufzuspüren. Die Verdünnungsplatte mit einer Metallgefrierdichtung abdecken. Sonde die Verdünnungsplatte in einem Eisbad für 30 s mit der Platte schweben in Eiswasser mit einer Zentrifuge Metall Eimer-Passung, um die Platte zu halten ( Abbildung 2A ). Übertragen Sie die beschallten Kulturen von der Verdünnungsplatte zu einer flachen Bodenplatte. Etiketten 4 x 96-well Flachbodenplatten 1, 2, 3 und 4 ( Abbildung 2B ). Transfer 150 &Nr. 181, L der Verdünnungsplatte aus den Vertiefungen A01 – D06 in die Wells C04 – F09 der mit 1 bezeichneten Platte. Dann werden 150 μl der Verdünnungsplatte aus den Vertiefungen A07 – D12 in die Wells C04 – F09 der mit 2 bezeichneten Platte überführt. Dann 150 μl übergeben Der Verdünnungsplatte aus den Vertiefungen E01 – H06 in die Vertiefungen C04 – F09 der mit der Beschriftung 3 versehenen Platte. 3. Umfassen Sie 150 μl der Verdünnungsplatte aus den Vertiefungen E07 – H12 in die Wells C04 – F09 der mit 4 bezeichneten Platte. Gehen Sie zu Schritt 4, Spotting auf Agar. 4. Spotting auf Agar mit einem automatisierten Liquid Spotting Roboter Entfernen Sie die bei 4 ° CO / N (ab Schritt 2.19) gespeicherten Agarose-Objektträger aus ihren befeuchteten sterilen Pipettenboxen. Wenn nötig, schneiden Sie die Ecken des Agarose-Mediums mit einer sauberen Rasierklinge ab, um sicherzustellen, dass sie auf die Schieberkammer passen. Entfernen Sie die Schiebeklemme von der Halterung. Setzen Sie die Agarplatte vorsichtig in den vertieften Bereich der Bühnenkammerhalterung. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die oderDie Entstehung der Folie ist vom Experiment bis zum Experiment konsistent. Überprüfen Sie, ob die Klemme bündig mit der Unterseite der Kammer ist. Wenn es krumm ist, dann kann der Schieber nicht vollständig im vertieften Bereich sitzen. Setzen Sie den Nivellier-Abstandshalter in die mittlere Plattenposition des Spotting-Roboters. Dieser Abstandshalter berührt die Nivellierschrauben, so dass die Schieberkammer mit den Spitzen geebnet werden kann. Legen Sie die Teller auf den Tisch in der Reihenfolge ihres Quadranten. Die Platten 1, 2, 3 und 4 wurden von links nach rechts geordnet ( Abbildung 2B ). Legen Sie die Spitzen so aus, dass die inneren 24 Wells C04 – F09 mit Spitzen in 4 leere Tipboxen besetzt sind. Eine fünfte Box muss eine Spitze in der C10-Position haben, sowie 4 Spitzen, deren Enden in den Positionen A01, A12, H01 und H12 abgeschnitten sind. Diese 4 abgeschnittenen Spitzen sorgen für Stabilität für die Spitzenplattenklemme ( Abbildung 2C und 2D ). Entfernen Sie die obere Abdeckung von der slIde Kammerhalterung Legen Sie den ersten Tip-Punch in die Start-Site des Roboter Control Spotting-Programm. Dies sollte ein Loch in die Agarose, die später verwendet werden, um die Ausrichtung der Ursprungs-Koordinate verwendet werden. Legen Sie die Platte 1 auf den Flüssigkeitshandhabungsroboter, um den ersten Quadranten zu lokalisieren. Vergewissern Sie sich, dass der Deckel entfernt ist und fahren Sie mit dem Spotting-Programm fort. Überprüfen Sie, ob alle Stellen vorhanden sind. Warten Sie auch 30 Minuten, bis sie trocknen. Wenn die Flecken etwa 1 mm im Durchmesser sind, kann das Programm fortfahren. Entleeren Sie die gebrauchten Spitzen in den Biohazard-Behälter und legen Sie frische Tipps auf den Roboter. Tauschen Sie die Platte 1 für die 2. Quadrantenplatte aus. Wiederholen Sie für den dritten Quadranten. Und wiederholen Sie sich wieder für den 4. Quadranten. Wenn die Flecken trocken sind, ersetzen Sie die Schieberkammerabdeckung und schlagen Sie das Gerät um. Installieren Sie die Schlauchverbindungen mit einem Luftfilter. Legen Sie einen Glasschieber auf die Oberseite der Kammer. HINWEIS: Diese Folie ist entscheidend für reduciNg den Wärmestrom zum Agar und minimiert die Bildung von Kondenswasser auf die Objektivabdeckungsseite der Kammer. Vergiss diesen Deckzettel nicht. Abhängig von der Mikroskopkonfiguration verhindert dieser Deckel, dass das Erwärmen von der Beleuchtungsseite zu einer Kondensation auf der Objektivseite führt. Positionieren Sie einen Ventilator, um heiße Luft auf die Objektivseite der Kammer zu blasen. Dieser Ventilator verhindert das Ausbilden von Kondenswasser auf dem Deckel. Stellen Sie den Luftstrom durch den Bubbler auf 10 mL / min ein. 5. ODELAY auf dem Mikroskop ausführen Führen Sie das Skript "ODELAY_Microscope_Control.m" aus. Klicken Sie auf den "Shutter", um den Durchblendlicht zu öffnen und dann die "Focus" -Taste, um die hohe Kamera-Rate einzuleiten ( Abbildung 3A , Rote Pfeile). Klicken Sie auf "Go Origin" und verschieben Sie die Bühne, um die Ursprungsmarke zu finden, die im Agar gestanzt wurde. Dann ziehe dich leicht nach rechtsFokus auf Hefezellen im Bereich E07. Gehe zurück zum Ursprung-Punsch und zentriere ihn im Gesichtsfeld. Stellen Sie den Ursprung auf diesen Wert ein, indem Sie die Taste "set" drücken ( Abbildung 3A , blaue Pfeile). Gehen Sie nun zur Position H18 und fokussieren Sie mit der Sechskantschraube, die dieser Stelle am nächsten liegt. Dann in Position L07 bewegen und mit der Sechskantschraube fokussieren, die dieser Stelle am nächsten liegt. Dann in Position E07 verschieben und mit der Sechskantschraube fokussieren, die dieser Stelle am nächsten liegt. Wiederholen Sie die Schritte 5.5 – 5.7, wenn diese Positionen im Fokus bleiben. Überprüfen Sie den Fokus in der Mitte und an den Kanten an den Stellen E12, H12, L12. Stellen Sie den Autofokusbereich ein, wenn die Fokus-Z-Werte, wie durch den Z-Wert angezeigt, größer als ± der Autofokusbereich sind ( z . B. stellen Sie den Autofokusbereich auf 60 μm den Z-Wert für einen Mittelpunkt ein, der größer als ± ist 40 μm). Drücken Sie die Reset-Taste, da dies die Tasteneigenschaften aktiviert und drücken Sie dannODELAY ( Abbildung 3A , grüne Pfeile). Wählen Sie das Verzeichnis, um die Daten zu speichern. Stellen Sie sicher, dass genügend Festplattenspeicher vorhanden ist. HINWEIS: Das Mikroskop sammelt Daten für 48 Stunden oder bis das Programm geschlossen ist. 6. Verarbeitung von ODELAY-Daten Öffnen Sie die ODELAY_IPT.exe oder verwenden Sie das Skript ODELAY_Image_Processing_Tool_v7.m Skript ( Abbildung 3C ). Vorbereiten einer * ODELAYExpDisc.xlsx Excel-Tabelle. Benennen Sie das Experiment in Zelle B1. Wählen Sie das Bildverzeichnis aus, in dem die Bilddateien E07 – H18 gespeichert sind. Wählen Sie das Datenverzeichnis aus, in dem Daten geschrieben werden sollen. Schreiben Sie das Datum, an dem das Experiment in die Zelle B04 gestartet wurde. Verwenden Sie das Format MM / TT / JJJJ. Schreiben Sie die Verdünnungszeit in Zelle C04. Diese Zeit dauert etwa fünf Minuten, bevor das erste Bild gesammelt wird. Verwenden Sie das Format HH: MMpm, wo HH für h und MM ist für min. Fügen Sie in die Stammnamen nach tO die Quellplatte (Schritt 3.1). Wegen der Art, wie Stämme entdeckt werden, werden sie auf der ODELAY-Agarose-Folie umgeordnet. Zellen in der Kalkulationstabelle B31-B126 sind die Quellplatte, während die Zellen C31 – C126 die Spotorte in der ODELAY Agarplatte sind. Dann betätigen Sie die Schaltfläche "Prozessdaten" und wählen Sie die * ODELAYExpDisc.xlsx, die gerade vorbereitet wurde. Warten Sie 16-24 h, abhängig vom Computersystem, das verwendet wird, um Daten zu verarbeiten. Wenn die Bilder verarbeitet werden, erscheint ein Verzeichnis mit dem Namen "ODELAY Well Data" und eine Datei "* _Index_ODELAYData.mat". Drücken Sie die Taste "Daten laden" und wählen Sie die gerade erzeugte Datei "* _Index_ODELAYData.mat" aus. Damit wird der gerade verarbeitete Datensatz geladen. Das "*" im Dateinamen wird nach dem in der Excel-Tabelle eingegebenen Experimentnamen aufgelistet. Nach dem Laden der Daten, überprüfen Sie es mit der Zeitleiste, die auf der Unterseite gefunden wird, klicken Sie auf ein Bild Quadrat, um Wachstumskurven zu sehen fOder diesen Ort, oder finden Sie einen Brunnen von Interesse in der Liste auf der linken Seite und laden Sie dann die Bilder für diese Liste. Erzeugen Sie Histogramme von Populationswachstumsparametern, indem Sie die Taste "Violine Plot" drücken. Dies erzeugt eine Darstellung, die in Fig. 4 oder Fig. 6 gezeigt ist .