ODELAY: Een grootschalige methode voor multiparameter kwantificering van gistgroei

1. Bereiding van agarose gelvoorraad Weeg 2 g agarose met een hoge zuiverheid af. Voeg de agarose toe aan een 500 ml fles en schrijf de gecombineerde massa op. Bereken de doelmassa van de fles plus 2 g agarose met 150 g ultrazuiver water en voeg dan 150 g ultrazuiver water toe aan binnen 0,1 g van deze doelmassa. Let op de massa van de fles plus de agarose en het water. Plaats de fles in een magnetron en zorg ervoor dat u de fles vastzet met een losse dop op de bovenkant om de waterverdamping te minimaliseren terwijl u de agarose verhit. Magnetron de fles in 15 – 20 s bursts gevolgd door de fles kort te draaien om de agarose en water te mengen. Herhaal deze procedure tot de oplossing kookt en het mengsel is homogeen. VOORZICHTIG: Zorg ervoor dat de huid niet wordt afgespild met stoom die uit de fles komt. Ook wordt de fles heet en kan de bescherming beschadigd worden, zoals een autoclaafhandschoen. Nadat de gesmolten agarose homogeen is, weeg de fles weer en voeg ultrauw water toe binnen 0,1 g van de originele massa. Dit zal vervangen worden door het verlies van water door verdamping. Voordat de gesmolten agarose stollt, wervel om te mengen in het toegevoegde water om homogeniteit te waarborgen. Aliquot 15,2 g agarose in 9 – 50 ml plastic buizen. Koel de buizen naar behoefte. 2. Voorbereiden van ODELAY Agarose Media Verhit 400 ml gedeïoniseerd water in een overdekte beker, op een kookplaat onder zacht roeren met een magnetische roerbalk. Voeg 2 ml 10X media ( bijv . Gist Extract Pepton (YEP) of Complete Supplement Mengsel (CSM) toe aan een 15,2 g agarose-aliquot in een 50 ml conische buis uit stap 1.10. OPMERKING: CSM-medium heeft de neiging om vast te houden aan de glazen glijbanen. Als u CSM media formuleringen gebruikt, voeg dan 5 μL 50% wt polyethyleenglycol (PEG) in steriel water toe aan de mediumformulering. De PEG voorkomt de aGar van het vasthouden aan de glazen glijbanen tijdens het loslaten van de schimmel en verhindert de gistengroei niet. Voeg extra 100X voedingssupplementen toe, indien nodig, en gebruik water om het totale toegevoegde volume van deze stap naar 1 ml te brengen. Weeg de agarose-aliquot met extra media en supplementen voordat u de 50 ml kegelbuis in kokend water van stap 2.1 plaatst. Na 16 minuten haal de 50 ml buis uit en meng het mengsel met een draaikolk. Houd de dop vast aan de 50 ml conische buis vast. OPMERKING: Een deksel op de beker helpt de gehele buis gelijkmatig te verwarmen, anders vormt een film van vaste agarose en eventueel niet smelt. Ook tijdens deze tijd is het handig om de agarosevorm te monteren ( figuur 1 ). Homogeniseer het mengsel met behulp van een draaikolk. Kook nog 2 minuten om ervoor te zorgen dat alle agar gemengd en gesmolten is. Weeg buis en vervang eventuele massa die met ultrazuiver steriel water is verloren. Voeg 2 ml 10X carbonzuur toeCe reagens ( bijv . 20% w / v glucose) en vortex om agarose medium oplossing te verkrijgen. OPMERKING: Scheiding van glazen glijbanen: Bij het monteren van de mal moet erop worden gezorgd dat de lange afstandhouders met de juiste oriëntatie in de vorm worden geplaatst. Dit komt doordat de laser de acryl snijdt, het heeft de neiging om te knippen als een kegel, waarbij het deel met een beetje hoekige zijden wordt verlaten in plaats van precies 90 ° kanten. Dan moet de rand van de spacer op een scherpe hoek zijn met de agar wanneer de vorm op de bencht geplaatst wordt om het glas uit de agar te laten lossen. De scherpe hoek helpt de rand van de agar weg van het bovenste glas te comprimeren, aangezien de buitenrand van de schimmelruimte om de onderrand draait (zie figuur 1 ). Het resultaat is een consistente scheiding van de agar uit het bovenste glas. OPMERKING: Mould release agentia toegepast op het glas zoals oliën, siliciumsprays of zelfs commerciële vensterbehandelingen mogen niet gebruikt worden omdat ze de s verontreinigen Oppervlak van de agar en mogelijk de groei remmen. Deze methoden hebben een aantal praktijken om consistent te zijn. Reinig vier 2 in x 3 in x 1 mm dikke glijbanen met 70% ethanol en droog met gedwongen lucht. Maak acrylvormen schoon met 70% ethanol, droog en monteer zoals afgebeeld in Figuur 1 . Neem de drie onderstukken, zoals afgebeeld, en monteer ze zodat de twee identieke stukken het derde stuk sandwichen ( figuur 1B ). Klem de basisstukken aan beide zijden aan met behulp van twee kleine binderclips ( figuur 1C ). Plaats de staander in de vorm en zorg ervoor dat de laserkapper correct is gepositioneerd ( Figuur 1E ). Plaats de gereinigde en gedroogde glazen glijplaat op de mal en houd hem vast terwijl u een tweede glazen glijbaan aan de andere kant plaatst. Bevestig de montage met een grotere bindmiddelclip ( Figuur 1D ). Pak beide glijbanen vast met grotere bindclips (Lass = "xfig"> Figuur 1D). Zorg ervoor dat de bovenste bindmiddelclip in contact is met de glazen glijbaan die overlapt met de acryl. Voeg resterende bindclips toe. Zorg er nogmaals voor dat de klemmen contact opnemen met de dia, waar het de acryl overlappt ( Figuur 1D ). OPMERKING: Voordat u de gemonteerde vorm met gesmolten agar opvult, dient u ervoor te zorgen dat de randen door middel van pipettering ongeveer 70 μl gesmolten agarmedia langs de binnenzijde van de vorm worden verzegeld. Deze agar zal snel stollen en voorkomen dat er lekken ontstaan. Vul de vorm met gesmolten agar, zorg ervoor dat de luchtbellen in de mal voorkomen worden. OPMERKING: dit kan worden bereikt door langzaam de gesmolten agar langs de rand van de mal te pipetteren. Nadat het is gevuld, laat de vorm gedurende 40 minuten tot 1 uur afkoelen bij ongeveer 23 ° C omgevingstemperatuur. Als het te lang afkoelt, kan de agar in de mal breken. OPMERKING: Schimmelvorming: Het verwijderen van de schimmelvorming van de gegoten agar is essentieel om een ​​uniforme vaste stof te waarborgenAgar pad voor gistengroei. Als u niet in staat bent om de schimmelvorming op deze stap doeltreffend te scheiden, veroorzaakt u groeiverschillen die te wijten zijn aan onvolkomenheden in het solide agarpaneel. Dit is een paar keer aanbevolen om deze stap uit te oefenen. Begin door de onderste binder clip te verwijderen. Verwijder het onderste gedeelte van de mal die bestaat uit de drie ingebonden stukken. Houd de dia's vast door ze te comprimeren en verwijder vervolgens de bindclips. Zorg ervoor dat u de vormkanten niet stoot terwijl u de bindklemmen verwijdert. Dit zal de media vervormen. Plaats de mal op de rand van de bankbovenkant zodat de zijde van de mal met de blauwe stip naar boven en in de linker benedenhoek staat ( Figuur 1E ). Plaats duimen onder de acryl en de eerste vinger aan de bovenkant naar de binnenkant van de mal. Duw langzaam en zorgvuldig met de duim tegen de matrijs omhoog, alsof de malafstand tussen de onderrand ( figuur 1F ) draait. Breng constant aanMaar langzaam toenemende druk. Gebruikers zullen een pauze zien en luchtbellen verschijnen langs de lijn waar het bovenste glas de vormruimte verdeelt. Nadat u de eerste pauze hebt gezien, blijft u met duimen omhoog duwen en constant druk toepassen. De agar moet op dit moment vanaf het glas wegbreken ( figuur 1F ). Ga door de vorm naar voren te draaien. Dit zal het glas opheffen zonder te glijden. Een lijn waar de agar wegvalt van het glas, moet zich verder bewegen van de eerste breeklijn. OPMERKING: op dit punt stopt de agar aan zowel de bodem als de bovenkant van het glas. Dit gebeurt af en toe met de linker meest rand. Zolang het gebied vervormd is, is het niet in het gebied waar gist is gespot, dit zou goed moeten zijn. Als het glas helemaal vrij komt, pak het en verwijder het helemaal uit de mal. Verwijder vervolgens het andere vormstuk met een soortgelijke beweging om het stuk los te maken zonder de agar te verplaatsen. Plaats de glijbanen in eenSteriele puntendoos met wat steriel water met hoge zuiverheid in de bodem. Sluit de doos en bewaren bij 4 ° CO / N voor gebruik de volgende dag. Als u langer wordt opgeslagen, worden de groeitempo inconsistent. 3. ODELAY Cultuurvoorbereiding Lay-out stammen in een 96-put plaat voor O / N groei. De volgende dag verdunnen 20 μL van de nachtcultuur in 200 μl media voor 220 μl totaal volume in een nieuwe plaat. Meet de optische dichtheid bij 600 nm (OD600) van elke cultuur in een plaatlezer. Volg het geautomatiseerde verdunningsprotocol van stappen 3.3.1 – 3.3.6 met behulp van een plaatlezer en een vloeibare behandelingsrobot. Verdun de culturen handmatig in de plaat tot ongeveer 0,1 OD600 (optioneel). Klik op de plaatlezer op "Experiment" onder "Creëer nieuw". Kies ODELAYDilution.exp en voer het experiment uit. Voer de experimentnaam in als ODELAY "Date" "Time" "Experiment Name" iteratie. Klik op de sTabblad tabellen en klik vervolgens op het Excel-icoon. Sla de gegevens op op een thumb drive en over te brengen naar een robot robot computer. Open de Robot's Layout and Method Editor. Open het methodebestand "ODELAYDilution_v1.med". Voer de uitvoerbare "Convert_SynergyFiles.exe" uit. Voer 0,09 voor doel OD600 in. Klik op "Glu Correction" en "Gal Correction" op 0,05. Meet blanco media in een identieke plaat. Klik op "Generate File". Selecteer het bestand in de methode-editor. Klik op het pictogram stoplicht om de methode te starten om het runtime-verdunningsprogramma te openen. Zorg ervoor dat de buizen niet open zijn en de platen hebben deksels verwijderd en de stofafdekkingen worden verwijderd van de tips. Laad platen, buizen en uiteinden op het dek van de vloeistofverwerkende robot, zoals aangegeven door de deklay-out. Klik op de knop 'Afspelen' om het verdunningsprogramma te starten. Selecteer het juiste aantal 50 μL tips. Selecteer het juiste aantal 300 μL tips. Wacht over12 minuten voor het proces te lopen. Neem de verdunningsplaat uit de robot, bedek de tips en pak de 15 ml mediabuisjes op. Kweek de plaat gedurende 5 – 6 uur bij 30 ° C. Ongeveer 1 – 2 uur voor het starten van de tweede verdunning zorg ervoor dat u de incubatiekamers voor de microscoop inschakelt. Laat ze evenwaren bij ° C of de temperatuur die nodig is voor het experiment. Herhaal de verdunningsstapjes 3.3 – 3.4, maar verdunde culturen aan een OD600 van 0,01-0,02 om de culturen op agaroseglazen te spotten. Bedek de verdunningsplaat met een metalen vriezerafdichting. Soniceer de verdunningsplaat in een ijsbad gedurende 30 s met de plaat die in ijswater drijft met behulp van een centrifuge metalen emmer om de plaat vast te houden ( figuur 2A ). Breng de sonicated culturen over van de verdunningsplaat naar een platte bodemplaat. Label 4 x 96-brede platte bodemplaten 1, 2, 3 en 4 ( Figuur 2B ). Overdracht 150 &# 181; L van de verdunningsplaat uit putten A01 – D06 in putten C04 – F09 van plaat gemerkt 1. Vervolgens 150 μL van de verdunningsplaat uit putten A07 – D12 in putjes C04 – F09 van plaat gemerkt 2. Vervolgens 150 μL Van de verdunningsplaat uit de putjes E01 – H06 in putten C04 – F09 van de plaat gemarkeerd. 3. Breng 150 μL van de verdunningsplaat van de putjes E07 – H12 uiteindelijk over in putjes C04 – F09 van de plaat gemerkt 4. Ga verder naar stap 4, Spotting on Agar. 4. Spotting op agar met behulp van een geautomatiseerde vloeibare spotting robot Verwijder de agarose glijbanen die zijn opgeslagen bij 4 ° C / N (vanaf stap 2.19) van hun bevochtigde steriele pipetdozen. Indien nodig, trim de hoeken van het agarosemedium met een schoon scheermesje om ervoor te zorgen dat ze op de glijkamer passen. Verwijder de diafragma van de beugel. Plaats de agarplaat voorzichtig in het inbouwvak van de podiumkamer. OPMERKING: Zorg ervoor dat de ofDe afname van de dia is consistent van experiment tot experiment. Controleer of de klem in de bodem van de kamer staat. Als het schuin is, dan is de dia mogelijk niet volledig in het ingebouwde gebied. Plaats de nivelleringsruimte in de middenplaatpositie van de spottrobot. Deze afstandsbediening zorgt voor contact voor de nivelleringsschroeven, zodat de diafragment met de tips kan worden geliquideerd. Plaats de borden op de tafel in volgorde van hun kwadrant. Platen 1, 2, 3 en 4 besteld van links naar rechts ( figuur 2B ). Leg de tips omhoog zodat de binnenste 24 putjes C04 – F09 met tips in 4 lege tipkasten worden bezet. Een vijfde doos moet één tip in de C10 positie hebben, evenals 4 tips met hun uiteinden afgesneden in de A01, A12, H01 en H12 posities. Deze 4 snijpunten zorgen voor stabiliteit voor de tipplaatklem ( Figuur 2C en 2D ). Verwijder de bovenklep van de slIde kamer mount. Plaats de eerste tip punch in de startplaats van het robot control spotting programma. Dit moet een gat in de agarose steken, die later gebruikt wordt voor het aanpassen van de oorsprong coördinaat. Plaats plaat 1 op de vloeistofverwerkende robot om het eerste kwadrant te detecteren. Zorg ervoor dat de deksel is verwijderd en ga door met het spotting programma. Controleer of alle plekken aanwezig zijn. Wacht ook ~ 30 s zodat ze kunnen drogen. Wanneer de plekken ongeveer 1 mm in diameter zijn, kan het programma doorgaan. Leeg de gebruikte tips in de biohazard container en plaats verse tips op de robot. Schakel plaat 1 uit voor de 2e kwadrantplaat. Herhaal voor het derde kwadrant. En herhaal opnieuw voor het vierde kwadrant. Wanneer de vlekken droog zijn, vervang de klep van de diafragma en draai het apparaat om. Installeer de slangverbindingen met een luchtfilter. Plaats een glazen glijbaan op de bovenkant van de kamer. OPMERKING: deze dia is cruciaal voor verminderingNg de warmteflux naar de agar en minimaliseert de vorming van condensatie op de objectieve afdekklepzijde van de kamer. Vergeet niet deze cover slip. Afhankelijk van de microscoopconfiguratie voorkomt deze afdekplaat verhitting van de verlichtingszijde om condensatie op de objectieve kant te veroorzaken. Plaats een ventilator om de hete lucht op de objectieve kant van de kamer te blazen. Deze ventilator voorkomt dat condensatie op de afdekkap vormt. Zet de luchtstroom door de bubbler tot 10 mL / min. 5. ODELAY draaien op microscoop Voer het script 'ODELAY_Microscope_Control.m' uit. Klik op de "Shutter" om de verzonden lichtluiter te openen en vervolgens de "Focus" knop om de hoge camera snelheid te starten ( Afbeelding 3A , Rode pijlen). Klik op "Ga herkomst" en verplaats het podium om het origineelmerk te vinden dat in de agar werd geslagen. Ga dan een beetje naar rechts naarFocus op gistcellen die in gebied E07 zijn opgespoord. Ga terug naar de origineelpunch en centreer het in het zichtveld. Stel de oorsprong in op deze waarde door op de knop "Set" te drukken ( Figuur 3A , Blauwe pijlen). Ga nu naar positie H18 en focus met behulp van de hexadekschroef die dichtst bij die locatie ligt. Ga dan naar positie L07 en focus met behulp van de zeskroef die dichtst bij die locatie ligt. Ga dan naar positie E07 en focus met behulp van de hex-schroef dichtst bij die locatie. Herhaal stap 5.5 tot en met 5.7, indien nodig, totdat die posities in focus blijven. Controleer de focus in het midden en aan de randen op plekken E12, H12, L12. Stel het autofocusbereik in als de Z-waarden van de focus, zoals aangegeven door de Z-waarde, groter zijn dan ± het autofocusbereik ( bijv . Stel het autofocusbereik in op 60 μm de Z-waarde voor een middelpunt die groter is dan ± 40 μm). Druk op de reset knop, aangezien dit de knop eigenschappen zal activeren en druk dan opODELAY ( Figuur 3A , Groene Pijlen). Kies de map om de gegevens op te slaan. Zorg ervoor dat er voldoende schijfruimte beschikbaar is. OPMERKING: De microscoop verzamelt gegevens gedurende 48 uur, of tot het programma is gesloten. 6. Verwerking ODELAY Data Open de ODELAY_IPT.exe of gebruik het script ODELAY_Image_Processing_Tool_v7.m script ( Figuur 3C ). Bereid een * ODELAYExpDisc.xlsx Excel-spreadsheet op. Noem het experiment in cel B1. Selecteer de Image Directory waar de afbeelding bestanden E07 – H18 zijn opgeslagen. Selecteer de Data Directory waar gegevens worden geschreven. Schrijf de datum waarop het experiment is begonnen met cel B04. Gebruik het formaat MM / DD / JJJJ. Schrijf de verdunningstijd in cel C04. Deze keer is ongeveer vijf minuten voordat de eerste afbeelding wordt verzameld. Gebruik het formaat HH: MMpm waar HH voor h is en MM is voor min. Voeg in de stamnamen toe volgens tO de bronplaat (stap 3.1). Vanwege de manier waarop de stammen worden gespot, worden ze op de ODELAY-agarose-schuif gerangschikt. Cellen in de spreadsheet B31-B126 zijn de bronplaat, terwijl de cellen C31 – C126 de plaats in de ODELAY agarplaat zijn. Druk dan op de "Process Data" knop en selecteer de * ODELAYExpDisc.xlsx die net werd voorbereid. Wacht 16-24 uur afhankelijk van het computersysteem dat wordt gebruikt om gegevens te verwerken. Wanneer de afbeeldingen worden verwerkt, verschijnt een map met de naam "ODELAY Well Data" en een bestand "* _Index_ODELAYData.mat". Druk op de knop 'Gegevens laden' en selecteer het bestand '* _Index_ODELAYData.mat' dat net is gegenereerd. Dit laadt de gegevensset die pas werd verwerkt. De "*" in de bestandsnaam wordt vermeld volgens de experimentnaam die in de Excel-spreadsheet is ingevoerd. Nadat u de gegevens hebt geladen, controleert u het met behulp van de tijdbalk bovenaan, klik op een afbeelding vierkant om de groeikurven te zien fOf die plek, of vind een bron van belang in de lijst aan de linkerkant en laad vervolgens de afbeeldingen voor die lijst. Genereer histogrammen van populatiegroei parameters door op de knop "Viool Plot" te drukken. Hierdoor wordt een grafiek weergegeven in figuur 4 of figuur 6 .