Bepaling van de chemische remmer efficiëntie tegen intracellulaire Toxoplasma Gondii Groei met behulp van een Luciferase-Based Growth Assay

Toxoplasma gondii is een zeer succesvolle obligate intracellulaire parasiet die ongeveer een derde van de menselijke bevolking infecteert. De hoge transmissiesnelheid is voornamelijk te wijten aan de diverse transmissieroutes, waaronder de consumptie van niet gaar vlees, blootstelling aan reservoirs van zoogdieren en aangeboren overdracht tijdens de geboorte. T. gondii veroorzaakt vooral opportunistische infecties die kunnen leiden tot ernstige morbiditeit en mortaliteit bij immuungecompromitteerde personen^1,2,3,4,5,6. De antibiotica die momenteel worden gebruikt voor de behandeling van acute toxoplasmose zijn bijzonder inefficiënt bij de behandeling van aangeboren en latente infecties en veroorzaken ernstige reacties bij sommige personen^3,7,8. Er bestaat dus een dringende behoefte om nieuwe therapieën te identificeren. Inzicht in de verschillen in subcellulaire processen binnen Toxoplasma en de gastheer ervan zal helpen om potentiële medicijndoelen te identificeren. Daarom zijn efficiënte en handige genoommanipulatietechnieken nodig om de rol van individuele genen binnen Toxoplasmate bestuderen. Bovendien behoort Toxoplasma tot de phylum Apicomplexa, die verschillende andere belangrijke menselijke ziekteverwekkers omvat, zoals Plasmodium spp. en Cryptosporidium spp. Vandaar dat Toxoplasma kan worden gebruikt als een modelorganisme om de basisbiologie in andere apicomplexe parasieten te bestuderen.

Om nieuwe antibiotica tegen microbiële pathogenen te identificeren, wordt een hoge doorvoerscreening van een bibliotheek van chemische verbindingen in eerste instantie uitgevoerd om hun werkzaamheid bij de onderdrukking van microbiële groei te bepalen. Tot nu toe zijn er verschillende op microplaat gebaseerde groeitesten ontwikkeld voor het meten van de intracellulaire groei van T. gondii (d.w.z., radioactief ³H-uracil-incificering-gebaseerde kwantificering⁹, kwantitatieve ELISA-gebaseerde parasietdetectie met behulp van T. gondii-specifiekeantilichamen^10,11, reporter protein-based measurement β-galactosidase of YFP-expressing Toxoplasma stammen^12,13, en een recent ontwikkelde high-content imaging assay¹⁴).

Deze individuele strategieën hebben allemaal unieke voordelen; bepaalde beperkingen beperken echter ook hun toepassingen. Bijvoorbeeld, omdat Toxoplasma alleen kan repliceren in nucleated dierlijke cellen, autofluorescentie en niet-specifieke binding vananti-T. gondii antilichamen aan gastheercellen veroorzaken interferentie in fluorescentie-gebaseerde metingen. Bovendien vereist het gebruik van radioactieve isotopen speciale veiligheidsvoorschriften en mogelijke veiligheidsproblemen. Sommige van deze tests zijn meer geschikt voor het beoordelen van de groei op een enkel tijdstip in plaats van continue monitoring van de groei.

Hier gepresenteerd is een luciferase-gebaseerd protocol voor de kwantificering van intracellulaire Toxoplasma groei. In een eerdere studie werd het NanoLuc luciferase-gen gekloond onder de Toxoplasma-tobulinpromotor, en deze luciferaseexpressieconstructie werd getransfecteerd tot wild-type (RHΔku80Δ Toxoplasma hxg-stam) parasieten om een RHΔku80Δhxgte creëren::NLuc-stam (aangeduid als RHΔku80::NLuc hiernamaals)¹⁵. Deze stam diende als de ouderlijke stam voor intracellulaire groeibepaling en gendeletie in deze studie. Met behulp van de RHΔku80::NLuc stam, parasiet groei in menselijke voorhuid fibroblasten (HFFs) werd gecontroleerd over een periode van 96 uur na de infectie om parasiet verdubbeling seinstijd te berekenen.

Bovendien kan de remmingswerkzaamheid van LHVS tegen de groei van parasieten worden bepaald door toxoplasma-groeicijfers te plotten tegen seriële LHVS-concentraties om de IC_50-waarde te identificeren. Eerdere literatuur heeft gemeld dat TgCPL een belangrijk doelwit is van LHVS bij parasieten en dat behandeling met LHVS de ontwikkeling van acute en chronische Toxoplasma-infecties ^{vermindert 16,17,18,19}. Daarnaast werd RHΔku80::NLuc gebruikt als de ouderlijke stam voor genoommodificatie om een TgCPL-gebrekkigestam te genereren (RHΔku80Δcpl::NLuc),en de remming van LHVS werd gemeten tegen deze mutant. Door het observeren van een upshift van IC_50-waarden voor LHVS in de TgCPL-gebrekkigeparasieten in vergelijking met de WT-stam, werd gevalideerd dat TgCPL het doelwit is van LHVS in vivo.

In dit protocol, RHΔku80::NLuc wordt gebruikt als de ouderlijke stam, die een efficiënte niet-homologe end-joining traject (NHEJ) ontbreekt, waardoor dubbele crossover homologie-afhankelijke recombinatie (HDR)^20,21. Bovendien worden 50 bp homologe regio’s geflankeerd aan beide uiteinden van een medicijnresistentiecassette door PCR. Het PCR-product dient als een reparatiesjabloon om de gehele genlocus via HDR te verwijderen met behulp van crispr-Cas9-gebaseerde genoombewerkingstools. Dergelijke korte homologe regio’s kunnen gemakkelijk worden opgenomen in primers, het verstrekken van een handige strategie voor de productie van de reparatie sjabloon. Dit protocol kan worden aangepast om universele gendeletie en enogene gentagging uit te voeren.

Bijvoorbeeld, in onze meest recente publicatie, drie protease genen, TgCPL, TgCPB (Toxoplasma cathepsin B-achtige protease), en TgSUB1 (Toxoplasma subtilisine-achtige protease 1), werden genetisch ablated in TgCRT (Toxoplasma chloroquine-resistentie transporter) -ficiënte parasieten met behulp van deze methode¹⁵. Bovendien werd TgAMN (een putatief aminopeptidase N [TgAMN, TGGT1_221310]) endogeen gelabeld¹⁵. Het Lourido-lab rapporteerde ook met behulp van korte homologe regio’s in het bereik van 40-43 bp voor de introductie van site-gerichte genmutatie en endogene gentagging in het Toxoplasma genoom met behulp van een soortgelijke methode²². Deze succesvolle genoommodificaties suggereren dat een homologe regio van 40-50 bp voldoende is voor een efficiënte DNA-recombinatie in de TgKU80-gebrekkigestam, wat genoommanipulatie in Toxoplasma gondiiaanzienlijk vereenvoudigt.