Luciferase Tabanlı Büyüme Testini Kullanarak Hücre İçi Toksoplazma Gondii Büyümesine Karşı Kimyasal Inhibitör Verimliliğin Belirlenmesi
Summary
Burada sunulan bir luciferase tabanlı büyüme tsay kullanarak Toxoplasma gondii in vitro hücre içi büyümeye karşı kimyasal bileşiklerin inhibisyon etkinliğini değerlendirmek için bir protokoldür. Bu teknik, ilgili hedef genin genetik olarak silinmesi ile inhibisyon özgüllüğünü doğrulamak için kullanılır. LHVS’nin TgCPL proteaza karşı inhibisyonu örnek olarak değerlendirilmektedir.
Abstract
Toksoplazma gondii yaygın insan popülasyonu etkileyen bir protozoon patojendir. Klinik toksoplazmoz tedavisinde kullanılan mevcut antibiyotikler sınırlıdır. Buna ek olarak, insanların bazı gruplarda yan etkiler sergilerler. Bu nedenle, klinik toksoplazmoz için yeni terapötik lerin keşfi zorunludur. Yeni antibiyotik gelişiminin ilk adımı, yüksek verim tarama stratejisi kullanarak parazit büyümesinin inhibisyonunda yüksek etkinlik gösteren kimyasal bileşikleri belirlemektir. Zorunlu bir hücre içi patojen olarak, Toxoplasma sadece konak hücreleri içinde çoğalabilir, bu da büyümenin hızlı bir göstergesi olarak optik emici ölçümlerin kullanımını yasaklar. Burada luciferase tabanlı büyüme test için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Örnek olarak, bu yöntem yabani tip Toxoplazma parazitlerinin iki katına saatini hesaplamak ve parazit intrasellüler büyümein inhibisyonu ile ilgili morolinurea-lucyl-homophenyl-vinil sülfone fenilin (LHVS, bir sistein proteaz hedefleme siper-hedefleme bileşiği) etkinliğini ölçmek için kullanılır. Ayrıca, homolojiye bağımlı rekombinasyon (HDR) için 50 bp homolog bölgeler kullanılarak Toxoplasma’da CRISPR-Cas9 tabanlı gen deletion protokolü de tanımlanmıştır. Yabani tip ve TgCPL (Toxoplasma cathepsin L benzeri proteaz) -eksik parazitlerde LHVS inhibisyon etkinliğini ölçerek, LHVS’nin Δcpl büyümesine göre yabani tip parazit büyümesini daha verimli bir şekilde engellediğini ve TGCPL’nin Toxoplasma’daLHVS’nin bağlanan bir hedef olduğunu düşündürmektedir. Bu luciferase bazlı büyüme testinin yüksek hassasiyeti ve kolay çalışması, Toxoplasma proliferasyonunun izlenmesi ve ilaç etkinliğinin yüksek verim li bir şekilde değerlendirilmesi için uygundur.
Introduction
Toksoplazma gondii insan nüfusunun yaklaşık üçte birini enfekte eden son derece başarılı bir hücre içi parazittir. Yüksek iletim hızı ağırlıklı olarak az pişmiş et tüketimi, memeli rezervuarlarına maruz kalma ve doğum sırasında konjenital iletim de dahil olmak üzere çeşitli iletim yolları kaynaklanmaktadır. T. gondii esas olarak immünazasyonlu bireylerde şiddetli morbidite ve mortaliteye yol açabilir fırsatçı enfeksiyonlara neden olur1,2,3,4,5,6. Şu anda akut toksoplazmoz tedavisinde kullanılan antibiyotikler konjenital ve gizli enfeksiyonların tedavisinde özellikle verimsiz ve bazı kişilerde şiddetli reaksiyonlara neden3,7,8. Böylece, acil bir ihtiyaç yeni terapötik belirlemek için var. Toxoplasma ve ev sahibi içindeki hücre altı süreçlerdeki farklılıkların anlaşılması potansiyel uyuşturucu hedeflerinin belirlenmesine yardımcı olacaktır. Bu nedenle, toxoplasmaiçinde bireysel genlerin rollerini incelemek için etkili ve uygun genom manipülasyon teknikleri gereklidir. Ayrıca, Toxoplasma phylum Apicomplexa aittir, Plasmodium spp. ve Cryptosporidium spp gibi diğer birçok önemli insan patojenleri içerir. Bu nedenle, Toxoplasma diğer apicomplexan parazitler temel biyoloji çalışmaya yardımcı olmak için bir model organizma olarak kullanılabilir.
Mikrobiyal patojenlere karşı yeni antibiyotikleri belirlemek için, mikrobiyal büyümenin bastırılmasında etkinliğini belirlemek için başlangıçta kimyasal bileşikler kütüphanesinin yüksek verim taraması yapılır. Şimdiye kadar, T hücre içi büyümesini ölçmek için çeşitli mikroplaka tabanlı büyüme tahlilleri geliştirilmiştir. gondii (yani, radyoaktif 3H-urasil kuruluş tabanlınicel9, t. gondii-spesifik antikorlar 10 kullanarak kantitatif ELISA tabanlı parazit tespiti10,11, β-galaktosidaz veya YFP ifade toksoplazma suşları12,13, ve son zamanlarda geliştirilen yüksek içerikli görüntüleme assay14).
Bu bireysel stratejilerin hepsinin benzersiz avantajları vardır; ancak, bazı sınırlamalar da uygulamalarını kısıtlar. Örneğin, Toxoplasma sadece çekirdekli hayvan hücrelerinde çoğalabildiği için, otofloresans veanti-T. gondii antikorlarının hücreleri barındırmak için spesifik olmayan bağlanması floresan bazlı ölçümlerde parazite neden olur. Ayrıca, radyoaktif izotopların kullanımı özel güvenlik uyumluluğu ve potansiyel güvenlik sorunları gerektirir. Bu tahlillerden bazıları, büyümeyi sürekli izlemek yerine büyümeyi tek bir zaman diliminde değerlendirmek için daha uygundur.
Burada sunulan hücre içi Toksoplazma büyüme nin nicelleştirilmesi için luciferase tabanlı bir protokoldür. Bir önceki çalışmada, NanoLuc luciferase geni Toxoplasma tubulin organizatörü altında klonlanmış ve bu luciferase ekspresyonu yapısı yabani tip (RHΔku80Δhxg suşu) parazitler içine bir RHΔku80Δhxgoluşturmak için transfeced oldu ::NLuc suşu (RHΔku80olarak anılacaktır ::NLuc afterafter)15. Bu suş bu çalışmada hücre içi büyüme tayini ve gen deletion için ebeveyn zorlanma olarak görev yaptı. RHΔku80kullanılarak ::NLuc suşu, insan sünnet derisi fibroblastlarında parazit büyümesi (HFF) parazit katlama süresini hesaplamak için 96 saatlik bir enfeksiyon sonrası dönemde izlendi.
Buna ek olarak, Parazit büyümesine karşı LHVS inhibisyonu etkinliği, IC50 değerini belirlemek için seri LHVS konsantrasyonlarına karşı Toxoplasma büyüme oranları çizilerek belirlenebilir. Önceki literatürtgCPL parazitlerde LHVS önemli bir hedef olduğunu ve LHVS ile tedavi akut ve kronik Toksoplazma enfeksiyonları16,17,,18,19gelişimini azalttığını bildirmiştir. Ayrıca, RHΔku80::NLuc bir TgCPL-eksik suşu oluşturmak için genom modifikasyonu için ebeveyn zorlanma olarak kullanılmıştır (RHΔku80Δcpl::NLuc), ve LHVS inhibisyonu bu mutant karşı ölçüldü. TgCPL-eksikparazitlerde LHVS için IC50 değerlerinin WT suşuna göre yükseltilerek, TgCPL’nin lhvs tarafından in vivo olarak hedeflendirildi.
Bu protokolde, RHΔku80::NLuc etkili bir homolog olmayan son birleştirme yolu (NHEJ) yoksun ebeveyn suşu olarak kullanılır, böylece çift crossover homoloji bağımlı rekombinasyon kolaylaştırmak (HDR)20,21. Ayrıca, 50 bp homolog bölgeler PCR tarafından bir ilaç direnci kaset her iki ucunda çevrilidir. PCR ürünü CRISPR-Cas9 tabanlı genom düzenleme araçları kullanarak HDR üzerinden tüm gen locus kaldırmak için bir onarım şablonu olarak hizmet vermektedir. Bu tür kısa homolog bölgeler kolayca astariçine dahil edilebilir, onarım şablonu üretimi için uygun bir strateji sağlayan. Bu protokol, evrensel gen silme ve endojen gen etiketleme gerçekleştirmek için değiştirilebilir.
Örneğin, en son yayınımızda, üç proteaz gen, TgCPL, TgCPB (Toxoplasma cathepsin B benzeri proteaz) ve TgSUB1 (Toxoplasma subtilisin benzeri proteaz 1), genetik olarak TgCRT (Toxoplasma kloroquine-direnç taşıyıcı) -bu yöntemi kullanarak eksik parazitler15. Ayrıca, TgAMN (bir putatif aminopeptidaz N [TgAMN, TGGT1_221310]) endojenetiketli 15. Lourido laboratuarı da benzer bir yöntem kullanarak Toxoplasma genomunda site yönelimli gen mutasyonu ve endojen gen etiketleme giriş için 40-43 bp aralığında kısa homolog bölgeler kullanılarak rapor22. Bu başarılı genom modifikasyonları, Toxoplasma gondii’dekigenom manipülasyonunu büyük ölçüde kolaylaştıran TgKU80-eksiksuşunda 40-50 bp homolog bölgenin verimli DNA rekombinasyonları için yeterli olduğunu göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
++Bu protokol, hücre içi Toksoplazma büyümesini değerlendirmek ve parazit büyümesine karşı kimyasal bileşiklerin inhibisyonu etkinliğini değerlendirmek için luciferase tabanlı bir protokolü tanımlar. Hücre içi Toksoplazma büyümesini ölçmek için mevcut stratejilerle karşılaştırıldığında, bu yöntem yüksek duyarlılık ve özgüllük sergiler. Parazit büyümesini izlerken, test edilen suşun değerlendirme süresinin bitiminden önce konak hücrelerini erken denemediğini …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar pSAG1-Cas9-sgRNA-TgUPRT plazmid ve anti-TgCPL ve TgActin antikorları paylaşımı için Dr Sibley ve Carruthers teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Clemson Startup fonu (Z.D.’ye), Knights Templar Eye Foundation Pediatrik Oftalmoloji Kariyer-Başlangıç Araştırma Hibesi (Z.D.’ye), NIH COBRE hibep20GM109094 (Z.D.’ye) ve NIH R01AI143707 (Z.D.’ye) tarafından desteklenmiştir. Fon layıcıların çalışma tasarımı, veri toplama ve analiz, makalenin yayımlama kararı veya hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.
Materials
| Agarose gel extraction kit | New England BioLabs | T1020L | |
| BamHI | New England BioLabs | R0316S | |
| Biotek Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader | BioTek Instuments | ||
| BTX Gemini Twin Waveform Electroporation System | Harvard Apparatus | ||
| Chemically competent E. coli cells | New England BioLabs | C29871 | |
| CloneAmp HiFi PCR premix | Takara Bio | 639298 | |
| Coelenterazine h | Prolume | 301-10 hCTZ | |
| EcoRV | New England BioLabs | R3195S | |
| Phire Tissue Direct PCR Master Mix | Thermo Scientific | F170L | |
| Plasmid miniprep kit | Zymo Research | D4054 | |
| Q5 Site-Directed Mutagenesis kit | New England BioLabs | E0554S | |
| Software | |||
| Geneious software for sgRNA design (version: R11) | |||
| GraphPad Prism software (8th version) | |||
| SnapGene for molecular cloning (version: 4.2.11) |
References
- Blader, I. J., Coleman, B. I., Chen, C. T., Gubbels, M. J. Lytic Cycle of Toxoplasma gondii: 15 Years Later. Annual Review of Microbiology. 69 (1), 1-23 (2014).
- Jones, J. L., Kruszon-Moran, D., Rivera, H., Price, C., Wilkins, P. P. Toxoplasma gondii Seroprevalence in the United States 2009-2010 and Comparison with the Past Two Decades. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 90 (6), (2014).
- Kieffer, F., Wallon, M. Congenital toxoplasmosis. Handbook of Clinical Neurology. 112, 1099-1101 (2013).
- Hoffmann, S., Batz, M. B., Morris, G. J. Annual cost of illness and quality-adjusted life year losses in the United States due to 14 foodborne pathogens. Journal of Food Protection. 75 (7), 1292-1302 (2012).
- Dubey, J. Toxoplasmosis. Journal of the American Veterinary Medical Association. 205 (11), 1593-1598 (1994).
- Lindsay, D., Dubey, J. Toxoplasma gondii: the changing paradigm of congenital toxoplasmosis. Parasitology. 138 (14), 1-3 (2011).
- Deng, Y., Wu, T., Zhai, S., Li, C. Recent progress on anti-Toxoplasma drugs discovery: Design, synthesis and screening. European Journal of Medicinal Chemistry. 183, 111711 (2019).
- Butler, N. J., Furtado, J. M., Winthrop, K. L., Smith, J. R. Ocular toxoplasmosis II: clinical features, pathology and management. Clinical & Experimental Ophthalmology. 41 (1), 95-108 (2013).
- Pfefferko, E., Pfefferko, L. C. Specific Labeling of Intracellular Toxoplasma gondii with Uracil. Journal of Eukaryotic Microbiology. 24 (3), 449-453 (1977).
- Merli, A., Canessa, A., Melioli, G. Enzyme immunoassay for evaluation of Toxoplasma gondii growth in tissue culture. Journal of Clinical Microbiology. 21 (1), 88-91 (1985).
- Derouin, F., Chastang, C. Enzyme immunoassay to assess effect of antimicrobial agents on Toxoplasma gondii in tissue culture. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 32 (3), 303-307 (1988).
- McFadden, D., Seeber, F., Boothroyd, J. Use of Toxoplasma gondii expressing beta-galactosidase for colorimetric assessment of drug activity in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (9), 1849-1853 (1997).
- Gubbels, M. J., Li, C., Striepen, B. High-Throughput Growth Assay for Toxoplasma gondii Using Yellow Fluorescent Protein. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (1), 309-316 (2003).
- Touquet, B., et al. High-content imaging assay to evaluate Toxoplasma gondii infection and proliferation: A multiparametric assay to screen new compounds. PLoS ONE. 13 (8), e0201678 (2018).
- Thornton, L. B., et al. An ortholog of Plasmodium falciparum chloroquine resistance transporter (PfCRT) plays a key role in maintaining the integrity of the endolysosomal system in Toxoplasma gondii to facilitate host invasion. PLOS Pathogens. 15 (6), e1007775 (2019).
- Larson, E. T., et al. Toxoplasma gondii cathepsin L is the primary target of the invasion-inhibitory compound morpholinurea-leucyl-homophenyl-vinyl sulfone phenyl. The Journal of Biological Chemistry. 284 (39), 26839-26850 (2009).
- Dou, Z., McGovern, O. L., Cristina, M., Carruthers, V. B. Toxoplasma gondii Ingests and Digests Host Cytosolic Proteins. mBio. 5 (4), e01188-14 (2014).
- Cristina, M., et al. Toxoplasma depends on lysosomal consumption of autophagosomes for persistent infection. Nature Microbiology. 2, 17096 (2017).
- Parussini, F., Coppens, I., Shah, P. P., Diamond, S. L., Carruthers, V. B. Cathepsin L occupies a vacuolar compartment and is a protein maturase within the endo/exocytic system of Toxoplasma gondii. Molecular Microbiology. 76 (6), 1340-1357 (2010).
- Huynh, M. H., Carruthers, V. B. Tagging of endogenous genes in a Toxoplasma gondii strain lacking Ku80. Eukaryotic cell. 8 (4), 530-539 (2009).
- Fox, B. A., Ristuccia, J. G., Gigley, J. P., Bzik, D. J. Efficient gene replacements in Toxoplasma gondii strains deficient for nonhomologous end joining. Eukaryotic Cell. 8 (4), 520-529 (2009).
- Sidik, S. M., Hackett, C. G., Tran, F., Westwood, N. J., Lourido, S. Efficient Genome Engineering of Toxoplasma gondii Using CRISPR/Cas9. PLoS ONE. 9 (6), e100450 (2014).
- Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, D. L. Efficient Gene Disruption in Diverse Strains of Toxoplasma gondii Using CRISPR/CAS9. mBio. 5 (3), e01114-14 (2014).
- Radke, J. R., et al. Defining the cell cycle for the tachyzoite stage of Toxoplasma gondii. Molecular and Biochemical Parasitology. 115 (2), 165-175 (2001).
- Ran, A. F., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Research. 44 (W1), W272-W276 (2016).
- Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nature Methods. 11 (2), 2812 (2014).
- Peng, D., Tarleton, R. EuPaGDT: a web tool tailored to design CRISPR guide RNAs for eukaryotic pathogens. Microbial Genomics. 1 (4), e000033 (2015).
- Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
- Sidik, S. M., et al. A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes. Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).
