Determinação da eficiência do inibidor químico contra o crescimento intracelular toxoplasma Gondii usando um ensaio de crescimento baseado em luciferase

Toxoplasma gondii é um parasita intracelular altamente bem sucedido que infecta aproximadamente um terço da população humana. Sua alta taxa de transmissão é predominantemente devido às suas diversas rotas de transmissão, incluindo consumo de carne mal cozida, exposição a reservatórios de mamíferos e transmissão congênita durante o nascimento. T. gondii causa principalmente infecções oportunistas que podem levar à morbidade e mortalidade graves em indivíduos imunocomprometidos^1,2,3,4,5,6. Os antibióticos atualmente utilizados no tratamento da toxoplasmose aguda são particularmente ineficientes no tratamento de infecções congênitas e latentes e causam reações severas em alguns indivíduos^3,7,8. Assim, existe uma necessidade urgente de identificar novas terapêuticas. Entender as diferenças nos processos subcelulares dentro do Toxoplasma e seu hospedeiro ajudará a identificar potenciais alvos de drogas. Portanto, técnicas eficientes e convenientes de manipulação do genoma são necessárias para estudar os papéis dos genes individuais dentro do Toxoplasma. Além disso, o Toxoplasma pertence ao filo Apicomplexa, que inclui vários outros patógenos humanos significativos, como Plasmodium spp. e Cryptosporidium spp. Assim, o Toxoplasma pode ser usado como um organismo modelo para ajudar a estudar a biologia básica em outros parasitas apicomplexos.

Para identificar novos antibióticos contra patógenos microbianos, a triagem de alto desempenho de uma biblioteca de compostos químicos é inicialmente realizada para determinar sua eficácia na repressão do crescimento microbiano. Até agora, vários ensaios de crescimento baseados em microplacas foram desenvolvidos para medir o crescimento intracelular de T. gondii (ou seja, quantificação radioativa ^baseadaem 3 H-uracil⁹, detecção quantitativa de parasitas baseados em ELISA usando anticorpos t. gondii-específicos^10,11, medição baseada em proteína de repórter usando β-galactosidase ou YFP expressante toxoplasma cepas^12,13, e um ensaio de imagem de alto conteúdo recentemente desenvolvido¹⁴).

Todas essas estratégias individuais têm vantagens únicas; no entanto, certas limitações também restringem suas aplicações. Por exemplo, uma vez que o Toxoplasma só pode se replicar dentro de células animais nucleadas, a autofluorescência e a ligação não específica de anticorpos anti-T.gondii às células hospedeiras causam interferência em medidas baseadas em fluorescência. Além disso, o uso de isótopos radioativos requer conformidade especial de segurança e potenciais problemas de segurança. Alguns desses ensaios são mais adequados para avaliar o crescimento em um único ponto de tempo, em vez de um monitoramento contínuo do crescimento.

Apresentado aqui é um protocolo baseado em luciferase para a quantificação do crescimento intracelular do Toxoplasma. Em um estudo anterior, o gene da luciferase de NanoLuc foi clonado sob o promotor da tubbulina Toxoplasma, e esta construção de expressão de luciferase foi transfeccionada em parasitas do tipo selvagem (RHΔku80Δhxg) para criar um RHΔku80Δhxg::NLuc strain (referido como RHΔku80::NLuc a seguir)¹⁵. Essa cepa serviu como a cepa parental para determinação do crescimento intracelular e exclusão genética neste estudo. Utilizando o RHΔku80:: A cepade NLuc, o crescimento de parasitas em fibroblastos de prepúcio humano (HFFs) foi monitorado durante um período de 96 h pós-infecção para calcular o tempo de duplicação do parasita.

Além disso, a eficácia da inibição do LHVS contra o crescimento de parasitas pode ser determinada plotando as taxas de crescimento do Toxoplasma contra concentrações de LHVS seriais para identificar o valor ic_50. A literatura anterior relatou que o TgCPL é um dos principais alvos de LHVS em parasitas e que o tratamento com LHVS diminui o desenvolvimento de infecções agudas e crônicas de Toxoplasma ^16,,17,18,19. Além disso, RHΔku80::NLuc foi usado como a cepa parental para modificação do genoma para gerar uma cepa tgCPL-deficiente(RHΔku80Δcpl::NLuc), e a inibição do LHVS foi medida contra este mutante. Ao observar uma mudança de valores de IC₅₀ para LHVS nos parasitas deficientes tgCPLem comparação com a cepa WT, foi validado que o TgCPL é alvo do LHVS in vivo.

Neste protocolo, RHΔku80::NLuc é usado como a cepa parental, que não tem um caminho de junção final não homólogo eficiente (NHEJ), facilitando assim a recombinação dupla mente dependente da homologia (HDR)^20,21. Além disso, as regiões homólogas de 50 bp são flanqueadas em ambas as extremidades de um de resistência a drogas por PCR. O produto PCR serve como um modelo de reparo para remover todo o lócus genético via HDR usando ferramentas de edição de genoma baseadas em CRISPR-Cas9. Tais regiões homólogos curtas podem ser facilmente incorporadas em primers, fornecendo uma estratégia conveniente para a produção do modelo de reparo. Este protocolo pode ser modificado para realizar a exclusão genética universal e a marcação endógena genética.

Por exemplo, em nossa publicação mais recente, três genes protease, TgCPL, TgCPB (Toxoplasma cathepsin B-like protease) e TgSUB1 (Toxoplasma subtilisin-like protease 1), foram geneticamente ablados em TgCRT (Toxoplasma cloroquina-resistência transporte)-deficientes parasitas usando este método¹⁵. Além disso, tgAMN (um aminopeptidase putativo N [TgAMN, TGGT1_221310]) foi marcado endógenamente¹⁵. O laboratório de Lourido também relatou o uso de regiões homólogos curtas na faixa de 40-43 bp para a introdução de mutação genética direcionada ao local e marcação de genes endógenos no genoma de Toxoplasma usando um método semelhante²². Essas modificações de genoma bem sucedidas sugerem que uma região homóloga de 40-50 bp é suficiente para uma recombinação eficiente de DNA na cepa tgKU80-deficiente, o que simplifica muito a manipulação do genoma em Toxoplasma gondii.