Определение эффективности химического ингибитора против внутриклеточного токсоплазмы Gondii Рост С помощью Люциферазы основе анализ роста

Toxoplasma gondii является весьма успешным обликирующим внутриклеточным паразитом, который поражает примерно треть населения человека. Его высокая скорость передачи в основном объясняется его разнообразными путями передачи, включая потребление недоваренного мяса, воздействие млекопитающих и врожденную передачу во время родов. T. gondii в основном вызывает оппортунистические инфекции, которые могут привести к тяжелой заболеваемости и смертности у лиц с ослабленным иммунитетом^{1,,2,,3,,4,,5,6}. Антибиотики в настоящее время используется для лечения острого токсоплазмоза особенно неэффективны в лечении врожденных и скрытых инфекций и вызвать тяжелые реакции у некоторых людей^3,7,8. Таким образом, существует настоятельная необходимость в выявлении новых терапевтических препаратов. Понимание различий в подклеточных процессах в токсоплазме и ее хозяине поможет определить потенциальные цели препарата. Поэтому для изучения роли отдельных генов в токсоплазменеобходимы эффективные и удобные методы манипуляции геномом. Кроме того, Toxoplasma относится к phylum Apicomplexa, которая включает в себя несколько других значительных человеческих патогенов, таких как Plasmodium spp. и Cryptosporidium spp. Таким образом, токсоплазма может быть использована в качестве модели организма, чтобы помочь изучить основные биологии в других паразитов apicomplexan.

Для выявления новых антибиотиков против микробных патогенов, высокая пропускная мощность скрининга библиотеки химических соединений первоначально проводится для определения их эффективности в подавлении роста микробов. До сих пор, несколько микроплит на основе роста анализы были разработаны для измерения внутриклеточного роста Т. gondii (т.е., радиоактивные ³H-uracil инкорпорации на основе количественной количественной ELISA основе обнаружения паразитов с использованием T. gondii-специфическиеантитела^10,11, репортер белка на основе измерения с использованием й-galactosidase или YFP-выражения Токсоплазма штаммов^12,13, и недавно разработанный высокосодержание изображения анализа¹⁴).⁹

Все эти индивидуальные стратегии имеют уникальные преимущества; однако некоторые ограничения также ограничивают их применение. Например, поскольку токсоплазма может размножаться только в нуклеарных клетках животных, аутофлуоресценция и неспецифические связыванияанти-T. gondii антител к клеткам-хозяинам вызывают вмешательство в измерения на основе флуоресценции. Кроме того, использование радиоактивных изотопов требует особого соблюдения требований безопасности и потенциальных проблем безопасности. Некоторые из этих анализов больше подходят для оценки роста в один момент, а не для непрерывного мониторинга роста.

Здесь представлен люциферазена основе протокола для количественной оценки внутриклеточного роста токсоплазмы. В предыдущем исследовании, NanoLuc luciferase ген был клонирован под toxoplasma тубулина промоутер, и это luciferase экспрессии построить был трансфицирован в дикий тип (RH’ku80ххг штамма) паразитов для создания RHq ku80хххгг::NLuc штамма (именуемый RH’ku80::NLuc далее.¹⁵ Этот штамм служил родительским штаммом для внутриклеточного определения роста и удаления генов в этом исследовании. Использование RH qku80::Штамм NLuc, рост паразитов в крайней плоти человека фибробластов (HFFs) был проконтролирован в течение 96 ч период после инфекции для расчета паразита удвоение времени.

Кроме того, эффективность ингибирования LHVS против роста паразитов может быть определена путем построения темпов роста токсоплазмы против последовательных концентраций LHVS для определения значения IC_50. Предыдущая литература сообщила, что TgCPL является основной мишенью LHVS у паразитов и что лечение LHVS снижает развитие острых и хронических инфекций токсоплазмы ^16,17,18,19. Кроме того, RH’ku80::NLuc был использован в качестве родительского штамма для модификации генома для создания штамма TgCPL-дефицит (RH’ku80qcpl::NLuc), и торможение LHVS был измерен против этого мутанта. Наблюдая upshift ic₅₀ значения для LHVS в TgCPL-дефицитныхпаразитов по сравнению с штаммом WT, было подтверждено, что TgCPL является мишенью LHVS in vivo.

В этом протоколе, RH’ku80::NLuc используется в качестве родительского штамма, который не имеет эффективного негомологического конца присоединения пути (NHEJ), тем самым облегчая двойной кроссовер гомологически химологии-зависимой рекомбинации (HDR)^20,21. Кроме того, 50 bp гомологичные области фланговые на обоих концах лекарственной устойчивости кассеты ПЦР. Продукт PCR служит шаблоном ремонта для удаления всего генного локуса через HDR с помощью инструментов редактирования генома на основе CRISPR-Cas9. Такие короткие гомологичные области могут быть легко включены в грунтовки, обеспечивая удобную стратегию для производства шаблона ремонта. Этот протокол может быть изменен для выполнения универсального удаления генов и эндогенных генов пометки.

Например, в нашей последней публикации, три гена протеазы, TgCPL, TgCPB (Токсоплазма катепсин B-как протеазы), и TgSUB1 (Токсоплазма субтилизин-как протеазы 1), были генетически ablated в TgCRT (Токсоплазма хлорокина-резистентность транспортер)¹⁵ Кроме того, TgAMN (побудительная аминопептидаза N «TgAMN, TGGT1_221310») был эндогенно помечен¹⁵. Лаборатория Лууридо также сообщила об использовании коротких гомологичных областей в диапазоне 40-43 bp для введения направляемой на сайт генной мутации и эндогенного гена, пометки в геноме Токсоплазмы с помощью аналогичного метода²². Эти успешные изменения генома предполагают, что 40-50 bp гомологичная область достаточна для эффективной рекомбинации ДНК в TgKU80-дефицитный штамм, который значительно упрощает манипуляции генома в Toxoplasma gondii.