Détermination de l’efficacité de l’inhibiteur chimique contre la croissance intracellulaire de Toxoplasma Gondii utilisant un essai de croissance basé sur luciferase
Summary
Présenté ici est un protocole pour évaluer l’efficacité d’inhibition des composés chimiques contre la croissance intracellulaire in vitro de Toxoplasma gondii en utilisant un essai de croissance à base de luciferase. La technique est utilisée pour confirmer la spécificité de l’inhibition par la suppression génétique du gène cible correspondant. L’inhibition de LHVS contre la protéase TgCPL est évaluée en exemple.
Abstract
Toxoplasma gondii est un agent pathogène protozoaire qui affecte largement la population humaine. Les antibiotiques actuels utilisés pour le traitement de la toxoplasmose clinique sont limités. En outre, ils présentent des effets secondaires indésirables dans certains groupes de personnes. Par conséquent, la découverte de nouvelles thérapies pour la toxoplasmose clinique est impérative. La première étape du développement d’antibiotiques de nouveau est d’identifier des composés chimiques montrant une efficacité élevée dans l’inhibition de la croissance des parasites à l’aide d’une stratégie de dépistage à haut débit. En tant qu’agent pathogène intracellulaire obligatoire, Toxoplasma ne peut se répliquer qu’à l’intérieur des cellules hôtes, ce qui interdit l’utilisation de mesures d’absorption optique comme indicateur rapide de croissance. Présenté ici est un protocole détaillé pour un essai de croissance basé sur la luciferase. À titre d’exemple, cette méthode est utilisée pour calculer le temps de doublement des parasites Toxoplasma de type sauvage et mesurer l’efficacité du phényl de sulfone morpholinurea-leucyl-homophenyl-vinyle (LHVS, un composé de protéase-ciblage de cystéine) concernant l’inhibition de la croissance intracellulaire parasite. Un protocole de suppression de gènes à base de CRISPR-Cas9 à base de CRISPR-Cas9 dans Toxoplasma utilisant 50 régions homologues de 50 bp pour la recombinaison dépendante de l’homologie (HDR). En quantifiant les efficacités d’inhibition du LHVS dans les parasites de type sauvage et TgCPL (Toxoplasma cathepsin L-like protease), il est démontré que le LHVS inhibe la croissance des parasites de type sauvage plus efficacement que la croissance de la TgCPL est une cible à laquelle LHVS se lie dans Toxoplasma. La sensibilité élevée et le fonctionnement facile de cet essai de croissance basé sur la luciferase le rendent approprié pour surveiller la prolifération de Toxoplasma et évaluer l’efficacité de drogue d’une manière élevée de débit.
Introduction
Toxoplasma gondii est un parasite intracellulaire obligatoire très réussi qui infecte environ un tiers de la population humaine. Son taux de transmission élevé est principalement dû à ses diverses voies de transmission, y compris la consommation de viande insuffisamment cuite, l’exposition aux réservoirs de mammifères et la transmission congénitale pendant la naissance. T. gondii provoque principalement des infections opportunistes qui peuvent conduire à une morbidité sévère et la mortalité chez les individus immunodéprimés1,2,3,4,5,6. Les antibiotiques actuellement utilisés pour le traitement de la toxoplasmose aigue sont particulièrement inefficaces dans le traitement des infections congénitales et latentes et provoquent des réactions graves chez certaines personnes3,7,8. Il existe donc un besoin urgent d’identifier de nouvelles thérapies. Comprendre les différences dans les processus subcellulaires au sein de Toxoplasma et de son hôte aidera à identifier les cibles potentielles de médicaments. Par conséquent, des techniques efficaces et pratiques de manipulation du génome sont nécessaires pour étudier les rôles des gènes individuels au sein de Toxoplasma. En outre, Toxoplasma appartient au phylum Apicomplexa, qui comprend plusieurs autres agents pathogènes humains importants, tels que Plasmodium spp. et Cryptosporidium spp. Par conséquent, Toxoplasma peut être utilisé comme un organisme modèle pour aider à étudier la biologie de base chez d’autres parasites apicomplexan.
Pour identifier de nouveaux antibiotiques contre les agents pathogènes microbiens, le dépistage à haut débit d’une bibliothèque de composés chimiques est initialement effectué pour déterminer leur efficacité dans la répression de la croissance microbienne. Jusqu’à présent, plusieurs essais de croissance à base de microplates ont été développés pour mesurer la croissance intracellulaire de T. gondii (c.-à-d. la quantification à base d’incorporation 3H-uracil9, la détection quantitative des parasites à base d’ELISA à l’aide de T. gondii-anticorps spécifiques10,11, la mesure protéinée journaliste à l’aide de souches Toxoplasma 12,13et une imagerie à haute teneur récemment développée assay14).
Ces stratégies individuelles ont toutes des avantages uniques; toutefois, certaines limitations limitent également leurs demandes. Par exemple, puisque Toxoplasma ne peut se répliquer qu’à l’intérieur des cellules animales nucléées, l’autofluorescence et la liaison non spécifique des anticorpsanti-T. gondii pour héberger des cellules provoquent des interférences dans les mesures à base de fluorescence. De plus, l’utilisation d’isotopes radioactifs exige une conformité particulière à la sécurité et des problèmes de sécurité potentiels. Certains de ces essais sont plus appropriés pour évaluer la croissance à un seul moment plutôt que la surveillance continue de la croissance.
Présenté ici est un protocole basé sur la luciferase pour la quantification de la croissance intracellulaire de Toxoplasma. Dans une étude précédente, le gène NanoLuc luciferase a été cloné sous le promoteur de toxoplasma tubulin, et cette construction d’expression luciferase a été transfected dans le type sauvage (RH-ku80ô hxg souche) parasites pour créer un RH‘ku80hxg::NLuc souche (appelé RH‘ku80::NLuc ici)15. Cette souche a servi de souche parentale pour la détermination intracellulaire de croissance et la suppression de gène dans cette étude. À l’aide duRH-ku80:: soucheNLuc, la croissance des parasites dans les fibroblastes en prépuce humain (FSF) a été surveillée sur une période de 96 h post-infection pour calculer le temps de doublement des parasites.
En outre, l’efficacité d’inhibition de LHVS contre la croissance de parasite peut être déterminée en traçant des taux de croissance de Toxoplasma contre des concentrations sérieuses de LHVS pour identifier la valeurIC 50. La littérature précédente a rapporté que TgCPL est une cible principale de LHVS dans les parasites et que le traitement avec LHVS diminue le développement des infections aigues et chroniques de Toxoplasma 16,17,18,19. En outre, RH-ku80::NLuc a été utilisé comme la souche parentale pour la modification du génome pour générer une souche TgCPLdéficiente (RH‘ku80‘cpl::NLuc), et l’inhibition de LHVS a été mesurée par rapport à ce mutant. En observant un décalage des valeurs IC50 pour LHVS dans les parasites TgCPL-déficientspar rapport à la souche WT, il a été validé que TgCPL est ciblé par LHVS in vivo.
Dans ce protocole,RH-ku80::NLuc est utilisé comme la souche parentale, qui n’a pas une voie efficace non-homologe de jointure (NHEJ), facilitant ainsi double multisegment homologie-dépendance recombinaison (HDR)20,21. En outre, 50 régions homologues bp sont flanqués aux deux extrémités d’une cassette de résistance aux médicaments par PCR. Le produit PCR sert de modèle de réparation pour enlever l’ensemble du locus génétique via HDR à l’aide d’outils d’édition du génome à base de CRISPR-Cas9. Ces courtes régions homologues peuvent être facilement incorporées dans les amorces, fournissant une stratégie pratique pour la production du modèle de réparation. Ce protocole peut être modifié pour effectuer la suppression universelle des gènes et le marquage des gènes endogènes.
Par exemple, dans notre publication la plus récente, trois gènes de protéase, TgCPL, TgCPB (Toxoplasma cathepsin B-like protease), et TgSUB1 (Toxoplasma subtilisin-like protease 1), ont été génétiquement ablés dans TgCRT (Toxoplasma chloroquine-resistance transporteur) -parasites déficients en utilisant cette méthode15. En outre, TgAMN (un aminopeptidase putatif N [TgAMN, TGGT1_221310]) a été étiqueté endogènement15. Le laboratoire de Lourido a également rapporté l’utilisation de régions homologues courtes dans la gamme de 40-43 bp pour l’introduction de la mutation génétique dirigée par le site et le marquage de gène endogène dans le génome de Toxoplasma utilisant une méthode similaire22. Ces modifications réussies du génome suggèrent qu’une région homologue de 40-50 bp est suffisante pour la recombinaison efficace de l’ADN dans la souche TgKU80-déficiente,qui simplifie grandement la manipulation du génome dans Toxoplasma gondii.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit un protocole basé sur la luciferase pour évaluer la croissance intracellulaire de Toxoplasma et évaluer l’efficacité de l’inhibition des composés chimiques contre la croissance des parasites. Comparée aux stratégies existantes disponibles pour mesurer la croissance intracellulaire de Toxoplasma, cette méthode présente une sensibilité et une spécificité élevées. Tout en surveillant la croissance des parasites, un essai simulé dans une microplaque claire de puits es…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tient à remercier les Drs Sibley et Carruthers d’avoir partagé des anticorps pSAG1-Cas9-sgRNA-TgUPRT et anti-TgCPL et TgActin. Ce travail a été soutenu par le fonds Clemson Startup (à Z.D.), Knights Templar Eye Foundation Pediatric Ophthalmology Career-Starter Research Grant (à Z.D.), une subvention pilote d’une subvention COBRE NIH P20GM109094 (à Z.D.), et NIH R01AI143707 (à Z.D.). Les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle à jouer dans la conception, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.
Materials
| Agarose gel extraction kit | New England BioLabs | T1020L | |
| BamHI | New England BioLabs | R0316S | |
| Biotek Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader | BioTek Instuments | ||
| BTX Gemini Twin Waveform Electroporation System | Harvard Apparatus | ||
| Chemically competent E. coli cells | New England BioLabs | C29871 | |
| CloneAmp HiFi PCR premix | Takara Bio | 639298 | |
| Coelenterazine h | Prolume | 301-10 hCTZ | |
| EcoRV | New England BioLabs | R3195S | |
| Phire Tissue Direct PCR Master Mix | Thermo Scientific | F170L | |
| Plasmid miniprep kit | Zymo Research | D4054 | |
| Q5 Site-Directed Mutagenesis kit | New England BioLabs | E0554S | |
| Software | |||
| Geneious software for sgRNA design (version: R11) | |||
| GraphPad Prism software (8th version) | |||
| SnapGene for molecular cloning (version: 4.2.11) |
References
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