使用基于路西法抹去的生长测定，确定化学抑制剂对细胞内弓形体贡迪生长的抑制效率

弓形虫是一种非常成功的细胞内寄生虫，它感染了大约三分之一的人类。其高传播率主要得益于其不同的传播途径，包括食用未煮熟的肉类、接触哺乳动物的水库以及分娩期间的先天性传播。T. Gondii主要导致机会性感染，可导致免疫功能^,低下的个人^{1，2，3，4，5，62,3}的严重发病率和死亡率。^4,5,61目前用于治疗急性弓形虫病的抗生素在治疗先天性和潜伏性感染方面效率特别低^{，在3、7、87,8}引起严重反应。³因此，迫切需要确定新的治疗方法。了解弓形虫及其宿主中亚细胞过程的差异将有助于确定潜在的药物靶点。因此，需要高效和方便的基因组操作技术来研究弓形体中单个基因的作用。此外，弓形虫属于植物性阿皮金，其中包括其他几种重要的人类病原体，如疟原虫和隐孢子虫。因此，弓形虫可以作为模型有机体，以帮助研究其他阿皮质寄生虫的基本生物学。

为了识别针对微生物病原体的新型抗生素，最初对化合物库进行了高通量筛选，以确定其在抑制微生物生长方面的有效性。到目前为止，已经开发出几种基于微孔板的生长测定法，用于测量T的细胞内生长。 贡迪（即放射性³H-uracil基于合并的定量^9，定量ELISA为基础的寄生虫检测使用T.贡迪特异性抗体10，11，记者蛋白质为基础的测量^10,11使用β-加拉西西酶或YFP表达弓形虫菌株^{12，13，,13}和最近开发的高含量成像检测^14）。

这些个别策略都有独特的优势;但是，某些限制也限制了其应用。例如，由于弓形体只能在核动物细胞内复制，因此自荧光和非特异性结合抗T.贡迪抗体对宿主细胞的宿主细胞会导致荧光测量的干扰。此外，使用放射性同位素需要特殊的安全合规性和潜在的安全问题。其中一些测定更适合在单个时间点评估增长，而不是持续监测增长。

此处介绍的是一种基于荧光酶的协议，用于定量细胞内弓形虫生长。在以前的研究中，NanoLuc Luciferase基因在弓形体图布林促进剂下被克隆，这种透明酶表达结构被转染成野生型（RH_ku80+hxg菌株）寄生虫，以产生RH_ku80=hxg：：hxgNLuc菌株（ku80称为RH_ku80：：后NLuc） ^15。ku80在这项研究中，这种菌株作为父母在细胞内生长测定和基因缺失的菌株。使用RH_ku80：：NLuc菌株，在感染后96小时期间监测人类前皮纤维细胞（HFFs）中的寄生虫生长，以计算寄生虫加倍的时间。

此外，通过绘制弓形虫酸的增长率以确定IC₅₀值，可以确定LHVS对寄生虫生长的抑制作用。此前有文献记载，TgCPL是寄生虫中LHVS的主要目标，使用LHVS治疗可减少急性和慢性^,17,18,19弓形虫^{感染的发展}。此外，RH_ku80：：NLuc用作用于基因组修饰的父母菌株，以产生TgCPL缺陷菌株（RH+ku80=cpl：：NLuc），并针对此突变体测量 LHVS 的抑制。通过观察TgCPL缺乏寄生虫中LHVS的IC₅₀值与WT菌株相比的向上变化，经验证TgCPL是LHVS体内的目标。

在此协议中，RH_ku80：：NLuc用作父母应变，缺乏有效的非同源端联通路（NHEJ），从而促进双交叉同源性重组（HDR）20，21。^20,21此外，50 bp 同源区域在 PCR 的耐药盒的两端侧翼。PCR 产品用作修复模板，使用基于 CRISPR-Cas9 的基因组编辑工具通过 HDR 去除整个基因位点。这种短的同源区域可以很容易地集成到底漆中，为维修模板的生产提供了方便的策略。可以修改该协议，执行通用基因删除和内源基因标记。

例如，在我们最近的出版物中，三个蛋白酶基因，TgCPL，TgCPB（弓形体乙型蛋白酶）和TgSUB1（弓形体亚骨素样蛋白酶1），在TgCRT（弓形素氯奎酮抗药性运输器）中基因消解，缺乏寄生虫使用这种方法^15。 TgCPB此外，TgAMN（一种假定的氨肽酶N[TgAMN，TGGT1_221310]）被内质标记¹⁵。Lourido实验室还报告说，使用40-43bp范围内的短同源区域，使用类似的方法²²在弓形体基因组中引入位点基因突变和内源基因标记。这些成功的基因组修改表明，40-50bp同源区域足以在TgKU80缺陷菌株中进行有效的DNA重组，这大大简化了弓形虫腺的基因组操作。