루시퍼라제 기반 성장 분석을 사용하여 세포내 톡소플라즈마 곤디성장에 대한 화학적 억제제 효율 결정
Summary
여기서 제시된 프로토콜은 루시퍼라제 기반 성장 분석을 사용하여 톡소플라즈마 곤디의 시험관내 세포내 성장에 대한 화학화합물의 억제 효능을 평가하는 프로토콜이다. 이 기술은 해당 표적 유전자의 유전적 결실에 의한 억제 특이성을 확인하는 데 사용된다. TgCPL 프로테아제에 대한 LHVS의 억제는 예로 평가된다.
Abstract
톡소플라즈마 곤디는 인간 인구에 널리 영향을 미치는 원생동물 병원체입니다. 임상 톡소플라즈마증 치료에 사용되는 현재 항생제는 제한적입니다. 또한, 그들은 사람들의 특정 그룹에 불리 한 부작용을 전시. 따라서 임상 톡소 플라즈마 증에 대한 새로운 치료법의 발견이 필수적입니다. 새로운 항생제 개발의 첫 번째 단계는 높은 처리량 선별 전략을 사용하여 기생충 성장억제에 높은 효능을 보이는 화학 화합물을 식별하는 것입니다. 의무적인 세포내 병원균으로서 Toxoplasma는 숙주 세포 내에서만 복제할 수 있으며, 이는 성장의 빠른 지표로서 광학 흡광도 측정의 사용을 금지합니다. 여기서 제시된 루시퍼라제 기반 성장 분석에 대한 상세한 프로토콜이다. 일례로, 이 방법은 야생형 톡소플라즈마 기생충의 두 배 시간을 계산하고 기생충 세포내 성장억제에 관한 모르폴리누레아-류필-호모페닐-비닐 설폰 페닐(LHVS, 시스테인 프로테아제 표적화합물)의 효능을 측정하는데 사용된다. 또한, 상동성 의존적 재조합(HDR)을 위한 50 bp 상동 영역을 사용하는 톡소플라즈마에서 CRISPR-Cas9 기반 유전자 결실 프로토콜이 기술된다. 야생형 및 TgCPL(톡소플라즈마 카테신 L-like protease)-결핍 기생충에서 LHVS의 억제 효능을 정량화함으로써, LHVS가 Δcpl 성장보다 야생형 기생충 성장을 보다 효율적으로 억제하는 것으로 나타났으며, 이는 TgCPL이 LHVS가 톡소플라즈마에결합하는 표적임을 시사한다.Toxoplasma 이 루시퍼라제 기반 성장 분석법의 높은 감도와 쉬운 작동은 톡소플라즈마 증식을 모니터링하고 높은 처리량 방식으로 약물 효능을 평가하는 데 적합합니다.
Introduction
톡소 플라즈마 곤디는 인간 인구의 약 1/3을 감염시키는 매우 성공적인 세포 내 기생충입니다. 그것의 높은 전송 속도는 주로 전염의 그것의 다양 한 경로 에 기인, undercooked 된 고기의 소비를 포함 하 여, 포유류 저수지에 노출, 그리고 출생 시 선천성 전송. T. gondii는 주로 면역 손상된개별에있는 가혹한 이환율 그리고 사망으로 이끌어 낼 수 있는 기회 감염을 일으키는 원인이 됩니다1,2,,3,,4,5,6.,6 현재 급성 톡소플라즈마증 치료에 사용되는 항생제는 선천성 및 잠복성 감염 치료에 특히 비효율적이며 일부3개인3,7,,8에서심각한 반응을 일으킨다. 따라서 새로운 치료법을 식별할 긴급한 필요성이 존재합니다. Toxoplasma 및 그 숙주 내의 세포내 과정의 차이를 이해하면 잠재적인 약물 표적을 식별하는 데 도움이 됩니다. 따라서, 효율적이고 편리한 게놈 조작 기술은 Toxoplasma내의 개별 적인 유전자의 역할을 공부하는 것을 요구됩니다. 또한, 톡소플라즈마는 플라스모듐 종과 크립토스포리듐 종과 같은 다른 중요한 인간 병원균을 포함하는 물리 균 Apicomplexa에 속한다. 따라서, Toxoplasma는 다른 양봉체 기생충에 있는 기본적인 생물학을 공부하는 것을 돕기 위하여 모형 유기체로 이용될 수 있습니다.
미생물 병원체에 대하여 새로운 항생제를 확인하기 위하여는, 화학 화합물의 도서관의 높은 처리량 검열은 미생물 성장의 억압에 있는 그들의 효험을 결정하기 위하여 처음에 수행됩니다. 지금까지, 몇몇 마이크로플레이트 기지를 둔 성장 측정은 T의 세포내 성장을 측정하기 위해 개발되었습니다. 곤디(즉, 방사성 3H-우라실 혼입 기반 정량화9, T. gondii-specific항체10,,11,β-갈락토시다아제 또는 YFP 발현 독소플라즈마 균주12,,13,및 최근 개발된 고함량을 이용한 단백질 기반 측정을 이용한 정량적 ELISA 기반 기생충 검출).14
이러한 개별 전략은 모두 고유한 장점을 가지고 있습니다. 그러나 특정 제한 사항도 응용 프로그램을 제한합니다. 예를 들어, Toxoplasma는 핵화 된 동물 세포 내에서만 복제 할 수 있기 때문에,항-T. gondii 항체의 자가 형광 및 비특이적 결합은 형광 기반 측정에서 간섭을 유발합니다. 또한 방사성 동위원소의 사용에는 특별한 안전 준수 및 잠재적안전 문제가 필요합니다. 이러한 검소 중 일부는 성장을 지속적으로 모니터링하기보다는 단일 시점에서 성장을 평가하는 데 더 적합합니다.
여기서 제시된 것은 세포내 톡소플라즈마 성장의 정량화를 위한 루시퍼라제 기반 프로토콜이다. 이전 연구에서, 나노루크 루시퍼라제 유전자는 톡소플라즈마 튜불린 프로모터하에 복제되었고, 이러한 루시퍼라제 발현 구조는 RHΔku80Δhxg를생성하기 위해 야생형(RHΔku80Δhxg 균주)으로 형질전환되었다::NLuc 균주(이하 RHΔku80::NLuc)는 15. 이 균주는 이 연구 결과에 있는 세포내 성장 결정 및 유전자 삭제를 위한 부모 긴장으로 봉사했습니다. RHΔku80을사용하여 ::NLuc 균주, 인간 포피 섬유아세포에서의 기생충 성장(HFFs)은 기생충 을 두 배로 계산하기 위해 감염 후 96시간 동안 모니터링하였다.
또한, 기생충 성장에 대한 LHVS의 억제 효능은 IC50 값을 식별하기 위해 직렬 LHVS 농도에 대하여 톡소플라즈마 성장 속도를 플로팅함으로써 결정될 수 있다. 이전 문헌은 TgCPL이 기생충에서 LHVS의 주요 표적이며 LHVS로 치료하는 것이 급성 및 만성 톡소플라즈마 감염의 발병을 감소시키고 있다고 보고했으며,16,,17,,18,,19. 추가적으로, RHΔku80::NLuc는 TgCPL-결핍균주를 생성하기 위한 게놈 변형을 위한 부모 균주로서 사용하였다(RHΔku80Δcpl::NLuc),및 LHVS의 억제는 이 돌연변이체에 대하여 측정되었다. TgCPL균주에 비해 TgCPL-결핍 기생충에서 LHVS에 대한 IC50 값의 상승 변화를 관찰함으로써, TgCPL이 생체 내 LHVS에 의해 표적화된다는 것이 입증되었다.
이 프로토콜에서, RHΔku80::NLuc는 효율적인 비 상동성 최종 결합 경로 (NHEJ)가 결여된 부모 변형으로 사용되어 이중 크로스 오버 상동성 의존 재결합 (HDR)20,,21을촉진합니다. 추가적으로, 50 bp 상동 영역은 PCR에 의한 약물 내성 카세트의 양단에 측면화된다. PCR 제품은 CRISPR-Cas9 기반 게놈 편집 도구를 사용하여 HDR을 통해 전체 유전자 궤적을 제거하는 수리 템플릿역할을 합니다. 이러한 짧은 상동 영역은 쉽게 수리 템플릿의 생산을위한 편리한 전략을 제공 프라이머에 통합 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 보편적인 유전자 결실 및 내인성 유전자 태깅을 수행하도록 변형될 수 있다.
예를 들어, 가장 최근의 간행물에서, 3개의 프로테아제 유전자, TgCPL, TgCPB (톡소플라즈마 카테신 B-like 프로테아제), 및 TgSUB1 (톡소플라즈마 서브틸리신 유사 프로테아제 1), 이 방법을 사용하여 TgCRT(톡소플라즈마 클로로퀸-내성 수송기)-결핍 파라소에 유전적으로 절제되었다15.Toxoplasma 또한, TgAMN TgAMN(아미노펩티다아제 N[TgAMN, TGGT1_221310])은내인성 태그(15)를태그하였다. Lourido lab은 또한 유사한 방법22를사용하여 톡소플라즈마 게놈에서 사이트 지향 유전자 돌연변이 및 내인성 유전자 태깅의 도입을 위해 40-43 bp의 범위에서 짧은 상동 영역을 사용하여 보고하였다. 이러한 성공적인 게놈 변형은 40-50 bp 상동 영역이 Toxoplasma 곤디에서게놈 조작을 크게 단순화하는 TgKU80-결핍균주에서 효율적인 DNA 재조합을 위해 충분하다는 것을 시사한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
++이 프로토콜은 세포내 톡소플라즈마 성장을 평가하고 기생충 성장에 대한 화학 화합물의 억제 효능을 평가하기 위한 루시퍼라제 기반 프로토콜을 설명합니다. 세포내 톡소플라즈마 성장을 측정하는 데 사용할 수 있는 기존 전략에 비해 이 방법은 높은 감도와 특이성을 나타낸다. 기생충 성장을 모니터링하는 동안, 명확한 96 웰 마이크로플레이트에서 모의 분석실험은 시험된 균주?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 pSAG1-Cas9-sgRNA-TgUPRT 플라스미드 및 항 TgCPL 및 TgActin 항체를 공유해 준 시블리 박사와 카루더에게 감사를 표하고 싶습니다. 이 작품은 클렘슨 스타트업 기금 (Z.D.), 기사 기사단 눈 재단 소아 안과 경력 – 스타터 연구 보조금 (Z.D.), NIH COBRE 교부금 P20GM109094 (Z.D.에), 그리고 NIH R01AI143707 (Z.D.)의 파일럿 보조금에 의해 지원되었다. 기금 모금자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할을 하지 않았습니다.
Materials
| Agarose gel extraction kit | New England BioLabs | T1020L | |
| BamHI | New England BioLabs | R0316S | |
| Biotek Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader | BioTek Instuments | ||
| BTX Gemini Twin Waveform Electroporation System | Harvard Apparatus | ||
| Chemically competent E. coli cells | New England BioLabs | C29871 | |
| CloneAmp HiFi PCR premix | Takara Bio | 639298 | |
| Coelenterazine h | Prolume | 301-10 hCTZ | |
| EcoRV | New England BioLabs | R3195S | |
| Phire Tissue Direct PCR Master Mix | Thermo Scientific | F170L | |
| Plasmid miniprep kit | Zymo Research | D4054 | |
| Q5 Site-Directed Mutagenesis kit | New England BioLabs | E0554S | |
| Software | |||
| Geneious software for sgRNA design (version: R11) | |||
| GraphPad Prism software (8th version) | |||
| SnapGene for molecular cloning (version: 4.2.11) |
References
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