Præsenteret her er en protokol til at evaluere hæmning effekten af kemiske forbindelser mod in vitro intracellulære vækst af Toxoplasma gondii ved hjælp af en luciferase-baseret vækst assay. Teknikken anvendes til at bekræfte hæmningspecificitet ved genetisk sletning af det tilsvarende målgen. Hæmning en LHVS mod TgCPL protease evalueres som et eksempel.
Toxoplasma gondii er en protozoer patogen, der i vid udstrækning påvirker den menneskelige befolkning. De nuværende antibiotika, der anvendes til behandling af klinisk toxoplasmose er begrænsede. Desuden, de udviser bivirkninger i visse grupper af mennesker. Derfor opdagelse af nye terapeutiske for klinisk toxoplasmose er bydende nødvendigt. Det første skridt i nye antibiotika udvikling er at identificere kemiske forbindelser, der viser høj effekt i hæmning af parasitvækst ved hjælp af en høj gennemløb screening strategi. Som et obligat intracellulært patogen kan Toxoplasma kun replikere i værtsceller, hvilket forbyder brugen af optiske absorbansmålinger som en hurtig indikator for vækst. Præsenteret her er en detaljeret protokol for en luciferase-baseret vækst analyse. Som et eksempel, denne metode bruges til at beregne fordobling tid af vilde-type Toxoplasma parasitter og måle effekten af morflære-leucyl-homophenyl-vinyl sulfon phenyl (LHVS, en cystein protease-målretning sammensatte) med hensyn til hæmning af parasitten intracellulær vækst. Også beskrevet, er en CRISPR-Cas9-baseret gen sletning protokol i Toxoplasma ved hjælp af 50 bp homologe regioner for homologi-afhængige rekombination (HDR). Ved at kvantificere hæmningseffekten af LHVS i vildtype og TgCPL (Toxoplasma cathepsin L-lignende protease)-mangelfuld parasitter, er det påvist, at LHVS hæmmer vildtype parasit vækst mere effektivt end Δcpl vækst, hvilket tyder på, at TgCPL er et mål, lHVS binder sig til i Toxoplasma. Den høje følsomhed og nem betjening af denne luciferase-baserede vækstanalyse gør den velegnet til overvågning af Toxoplasma-spredning og evaluering af lægemidlets effektivitet på en høj gennemløbsmåde.
Toxoplasma gondii er en meget vellykket forpligte intracellulære parasit, der inficerer cirka en tredjedel af den menneskelige befolkning. Denhøje transmissionshastighed skyldes hovedsagelig dens forskellige transmissionsveje, herunder forbrug af utilstrækkeligt kød, eksponering for pattedyrsreservoirer og medfødt transmission under fødslen. T. gondii forårsager hovedsagelig opportunistiske infektioner , der kan føre til alvorlig sygelighed og dødelighed hos immunkompromitterede personer1,2,3,4,5,6. De antibiotika , der i øjeblikket anvendes til behandling af akut toxoplasmose, er særligt ineffektive til behandling af medfødte og latente infektioner og forårsager alvorlige reaktioner hos nogle personer3,7,8. Således er der et presserende behov for at identificere nye terapeutiske eksisterer. Forståelse af forskellene i subcellulære processer i Toxoplasma og dets vært vil bidrage til at identificere potentielle narkotika mål. Derfor er der behov for effektive og bekvemme genommanipulationsteknikker for at undersøge rollerne af de enkelte gener i Toxoplasma. Derudover, Toxoplasma tilhører phylum Apicomplexa, som omfatter flere andre væsentlige menneskelige patogener, såsom Plasmodium spp. og Cryptosporidium spp. Derfor kan Toxoplasma bruges som en model organisme til at hjælpe med at studere grundlæggende biologi i andre apicomplexan parasitter.
For at identificere nye antibiotika mod mikrobielle patogener udføres der i første omgang screening af et bibliotek med kemiske forbindelser med høj gennemløb for at bestemme deres effektivitet i undertrykkelsen af mikrobiel vækst. Indtil videre er der udviklet flere mikropladebaserede vækstanalyser til måling af intracellulær vækst af T. gondii (dvs. radioaktiv3H-uracil inkorporering-baseret kvantificering9, kvantitativ ELISA-baseret parasitpåvisning ved hjælp af T. gondii-specifikke antistoffer10,,11, reporter proteinbaseret måling ved hjælp af β-galactosidase eller YFP-ekspres Toxoplasma stammer12,,13, og en nyligt udviklet højt indhold billeddannelse assay14).
Disse individuelle strategier har alle unikke fordele; visse begrænsninger begrænser dog også deres anvendelse. For eksempel, da Toxoplasma kun kan replikere inden for nucleated dyreceller, autofluorescens og ikke-specifik binding af anti-T. gondii antistoffer til værtsceller forårsage interferens i fluorescens-baserede målinger. Desuden kræver brugen af radioaktive isotoper særlig sikkerhedsoverensstemmelse og potentielle sikkerhedsproblemer. Nogle af disse analyser er mere velegnede til at vurdere væksten på et enkelt tidspunkt i stedet for løbende overvågning af væksten.
Præsenteret her er en luciferase-baseret protokol for kvantificering af intracellulære Toxoplasma vækst. I en tidligere undersøgelse blev Nanoluc luciferase-genet klonet under Toxoplasma tubulinpromotor, og denne luciferase ekspressionskonstruktion blev transfected til vilde (RHΔku80Δhxg stamme) parasitter for at skabe en RHΔku80Δhxg::NLuc stamme (benævnt RHΔku80::NLuc herefter)15. Denne stamme tjente som forældrenes stamme for intracellulær vækst bestemmelse og gensletning i denne undersøgelse. Ved hjælp af RHΔku80::NLuc stamme, parasit vækst i human forhuden fibroblaster (HFFs) blev overvåget over en 96 h periode efter infektion til at beregne parasit fordobling tid.
Desuden kan lhvs hæmningseffekt mod parasitvækst bestemmes ved at plotte Toxoplasma-vækstrater i forhold til serielle LHVS-koncentrationer for at identificere IC50-værdien. Tidligere litteratur har rapporteret, at TgCPL er et vigtigt mål for LHVS hos parasitter , og at behandling med LHVS nedsætter udviklingen af akutte og kroniske Toxoplasma-infektioner 16,17,18,19. Derudover blev RHΔku80::NLuc brugt som forældrestamme for genommodifikation for at generere en TgCPL-mangelfuldstamme (RHΔku80Δcpl::NLuc), og hæmningen af LHVS blev målt i forhold til denne mutant. Ved at observere en upshift af IC50 værdier for LHVS i TgCPL-mangelfuldparasitter i forhold til WT stamme, blev det valideret, at TgCPL er målrettet af LHVS in vivo.
I denne protokol, RHΔku80::NLuc bruges som forældrenes stamme, som mangler en effektiv ikke-homolog end-sammenføjning vej (NHEJ), hvilket letter dobbelt crossover homologi-afhængige rekombination (HDR)20,21. Derudover er 50 bp homologe regioner flankeret i begge ender af en lægemiddelresistenskassette af PCR. PCR-produktet fungerer som en reparationsskabelon til at fjerne hele genlocus via HDR ved hjælp af CRISPR-Cas9-baserede genomredigeringsværktøjer. Sådanne korte homologe regioner kan nemt indarbejdes i primere, hvilket giver en bekvem strategi for produktion af reparationsskabelonen. Denne protokol kan ændres til at udføre universel gensletning og endogen genmærkning.
For eksempel, i vores seneste publikation, tre protease gener, TgCPL, TgCPB (Toxoplasma cathepsin B-lignende protease), og TgSUB1 (Toxoplasma subtilisin-lignende protease 1), blev genetisk ablated i TgCRT (Toxochloroquine-resistens transportør)-mangelfuld parasitter ved hjælp af denne metode15. Derudover blev TgAMN (et formodet aminopeptidmiddel N [TgAMN, TGGT1_221310]) endogent mærket15. Lourido-laboratoriet rapporterede også ved hjælp af korte homologe regioner i intervallet 40-43 bp til indførelse af stedstyret genmutation og endogen genmærkning i Toxoplasma-genomet ved hjælp af en lignende metode22. Disse vellykkede genom modifikationer tyder på, at en 40-50 bp homolog region er tilstrækkelig til effektiv DNA rekombination i TgKU80-mangelfuldstamme, som i høj grad forenkler genom manipulation i Toxoplasma gondii.
++Denne protokol beskriver en luciferase-baseret protokol til vurdering af intracellulær Toxoplasma vækst og evaluere hæmning effekten af kemiske forbindelser mod parasitvækst. Sammenlignet med de eksisterende strategier til måling af intracellulær Toxoplasma vækst, denne metode udviser høj følsomhed og specificitet. Mens overvågning parasit vækst, en mock assay i en klar 96 godt mikroplade anbefales at bekræfte, at den testede stamme ikke for tidligt lyse værtsceller inden udgangen af eval…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Drs. Sibley og Carruthers for deling pSAG1-Cas9-sgRNA-TgUPRT plasmid og anti-TgCPL og TgActin antistoffer. Dette arbejde blev støttet af Clemson Startup fund (til Z.D.), Knights Templar Eye Foundation Pediatric Oftalmology Career-Starter Research Grant (til Z.D.), et pilottilskud til en NIH COBRE-bevilling P20GM109094 (til Z.D.) og NIH R01AI143707 (til Z.D.). Finansieringsgiverne havde ingen rolle i studiedesign, dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre eller udarbejde manuskriptet.
Agarose gel extraction kit | New England BioLabs | T1020L | |
BamHI | New England BioLabs | R0316S | |
Biotek Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader | BioTek Instuments | ||
BTX Gemini Twin Waveform Electroporation System | Harvard Apparatus | ||
Chemically competent E. coli cells | New England BioLabs | C29871 | |
CloneAmp HiFi PCR premix | Takara Bio | 639298 | |
Coelenterazine h | Prolume | 301-10 hCTZ | |
EcoRV | New England BioLabs | R3195S | |
Phire Tissue Direct PCR Master Mix | Thermo Scientific | F170L | |
Plasmid miniprep kit | Zymo Research | D4054 | |
Q5 Site-Directed Mutagenesis kit | New England BioLabs | E0554S | |
Software | |||
Geneious software for sgRNA design (version: R11) | |||
GraphPad Prism software (8th version) | |||
SnapGene for molecular cloning (version: 4.2.11) |