Bestemmelse af kemisk inhibitor effektivitet mod intracellulære Toxoplasma Gondii vækst ved hjælp af en Luciferase-baseret vækst assay

Toxoplasma gondii er en meget vellykket forpligte intracellulære parasit, der inficerer cirka en tredjedel af den menneskelige befolkning. Denhøje transmissionshastighed skyldes hovedsagelig dens forskellige transmissionsveje, herunder forbrug af utilstrækkeligt kød, eksponering for pattedyrsreservoirer og medfødt transmission under fødslen. T. gondii forårsager hovedsagelig opportunistiske infektioner , der kan føre til alvorlig sygelighed og dødelighed hos immunkompromitterede personer^1,2,3,4,5,6. De antibiotika , der i øjeblikket anvendes til behandling af akut toxoplasmose, er særligt ineffektive til behandling af medfødte og latente infektioner og forårsager alvorlige reaktioner hos nogle personer^3,7,8. Således er der et presserende behov for at identificere nye terapeutiske eksisterer. Forståelse af forskellene i subcellulære processer i Toxoplasma og dets vært vil bidrage til at identificere potentielle narkotika mål. Derfor er der behov for effektive og bekvemme genommanipulationsteknikker for at undersøge rollerne af de enkelte gener i Toxoplasma. Derudover, Toxoplasma tilhører phylum Apicomplexa, som omfatter flere andre væsentlige menneskelige patogener, såsom Plasmodium spp. og Cryptosporidium spp. Derfor kan Toxoplasma bruges som en model organisme til at hjælpe med at studere grundlæggende biologi i andre apicomplexan parasitter.

For at identificere nye antibiotika mod mikrobielle patogener udføres der i første omgang screening af et bibliotek med kemiske forbindelser med høj gennemløb for at bestemme deres effektivitet i undertrykkelsen af mikrobiel vækst. Indtil videre er der udviklet flere mikropladebaserede vækstanalyser til måling af intracellulær vækst af T. gondii (dvs. ^radioaktiv3H-uracil inkorporering-baseret kvantificering⁹, kvantitativ ELISA-baseret parasitpåvisning ved hjælp af T. gondii-specifikke antistoffer^10,,11, reporter proteinbaseret måling ved hjælp af β-galactosidase eller YFP-ekspres Toxoplasma stammer^12,,13, og en nyligt udviklet højt indhold billeddannelse assay¹⁴).

Disse individuelle strategier har alle unikke fordele; visse begrænsninger begrænser dog også deres anvendelse. For eksempel, da Toxoplasma kun kan replikere inden for nucleated dyreceller, autofluorescens og ikke-specifik binding af anti-T. gondii antistoffer til værtsceller forårsage interferens i fluorescens-baserede målinger. Desuden kræver brugen af radioaktive isotoper særlig sikkerhedsoverensstemmelse og potentielle sikkerhedsproblemer. Nogle af disse analyser er mere velegnede til at vurdere væksten på et enkelt tidspunkt i stedet for løbende overvågning af væksten.

Præsenteret her er en luciferase-baseret protokol for kvantificering af intracellulære Toxoplasma vækst. I en tidligere undersøgelse blev Nanoluc luciferase-genet klonet under Toxoplasma tubulinpromotor, og denne luciferase ekspressionskonstruktion blev transfected til vilde (RHΔku80Δhxg stamme) parasitter for at skabe en RHΔku80Δhxg::NLuc stamme (benævnt RHΔku80::NLuc herefter)¹⁵. Denne stamme tjente som forældrenes stamme for intracellulær vækst bestemmelse og gensletning i denne undersøgelse. Ved hjælp af RHΔku80::NLuc stamme, parasit vækst i human forhuden fibroblaster (HFFs) blev overvåget over en 96 h periode efter infektion til at beregne parasit fordobling tid.

Desuden kan lhvs hæmningseffekt mod parasitvækst bestemmes ved at plotte Toxoplasma-vækstrater i forhold til serielle LHVS-koncentrationer for at identificere IC_50-værdien. Tidligere litteratur har rapporteret, at TgCPL er et vigtigt mål for LHVS hos parasitter , og at behandling med LHVS nedsætter udviklingen af akutte og kroniske Toxoplasma-infektioner ^16,17,18,19. Derudover blev RHΔku80::NLuc brugt som forældrestamme for genommodifikation for at generere en TgCPL-mangelfuldstamme (RHΔku80Δcpl::NLuc), og hæmningen af LHVS blev målt i forhold til denne mutant. Ved at observere en upshift af IC₅₀ værdier for LHVS i TgCPL-mangelfuldparasitter i forhold til WT stamme, blev det valideret, at TgCPL er målrettet af LHVS in vivo.

I denne protokol, RHΔku80::NLuc bruges som forældrenes stamme, som mangler en effektiv ikke-homolog end-sammenføjning vej (NHEJ), hvilket letter dobbelt crossover homologi-afhængige rekombination (HDR)^20,21. Derudover er 50 bp homologe regioner flankeret i begge ender af en lægemiddelresistenskassette af PCR. PCR-produktet fungerer som en reparationsskabelon til at fjerne hele genlocus via HDR ved hjælp af CRISPR-Cas9-baserede genomredigeringsværktøjer. Sådanne korte homologe regioner kan nemt indarbejdes i primere, hvilket giver en bekvem strategi for produktion af reparationsskabelonen. Denne protokol kan ændres til at udføre universel gensletning og endogen genmærkning.

For eksempel, i vores seneste publikation, tre protease gener, TgCPL, TgCPB (Toxoplasma cathepsin B-lignende protease), og TgSUB1 (Toxoplasma subtilisin-lignende protease 1), blev genetisk ablated i TgCRT (Toxochloroquine-resistens transportør)-mangelfuld parasitter ved hjælp af denne metode¹⁵. Derudover blev TgAMN (et formodet aminopeptidmiddel N [TgAMN, TGGT1_221310]) endogent mærket¹⁵. Lourido-laboratoriet rapporterede også ved hjælp af korte homologe regioner i intervallet 40-43 bp til indførelse af stedstyret genmutation og endogen genmærkning i Toxoplasma-genomet ved hjælp af en lignende metode²². Disse vellykkede genom modifikationer tyder på, at en 40-50 bp homolog region er tilstrækkelig til effektiv DNA rekombination i TgKU80-mangelfuldstamme, som i høj grad forenkler genom manipulation i Toxoplasma gondii.