تحديد كفاءة المثبط الكيميائي ضد نمو توكسوبلازما غوندي داخل الخلايا باستخدام قياس النمو القائم على لوسيفيراز
Summary
عرض هنا هو بروتوكول لتقييم فعالية تثبيط المركبات الكيميائية ضد في المختبر النمو داخل الخلايا من غوندي توكسوبلازما باستخدام اسيه النمو القائم على لوسيفيراز. وتستخدم هذه التقنية لتأكيد التحديد تثبيط عن طريق الحذف الوراثي للجين المستهدف المقابلة. يتم تقييم تثبيط LHVS ضد بروتياز TgCPL كمثال.
Abstract
توكسوبلازما غوندي هو مسببات الأمراض الأولية التي تؤثر على نطاق واسع في البشر. المضادات الحيوية الحالية المستخدمة لعلاج التهاب التوكسوبلازمات السريرية محدودة. وبالإضافة إلى ذلك، فإنها تظهر آثار جانبية سلبية في مجموعات معينة من الناس. لذلك ، فإن اكتشاف علاجات جديدة لـ toxoplasmosis السريري أمر حتمي. الخطوة الأولى من تطوير المضادات الحيوية الجديدة هي تحديد المركبات الكيميائية التي تظهر فعالية عالية في تثبيط نمو الطفيليات باستخدام استراتيجية فحص الإنتاجية العالية. وباعتبارها ممرضاً ملزماً داخل الخلايا، لا يمكن لتوكسوبلازما أن تتكرر إلا داخل الخلايا المضيفة، مما يحظر استخدام قياسات الامتصاص البصري كمؤشر سريع للنمو. عرض هنا هو بروتوكول مفصل لسيفراز القائم على تقييم النمو. على سبيل المثال ، يتم استخدام هذه الطريقة لحساب وقت مضاعفة طفيليات توكسوبلازما البرية وقياس فعالية مورفولاينيوريا – لوسيل – homophenyl – الفينيل السلفون الفينيل (LHVS ، وهو مركب استهداف البروتياز السيستين) فيما يتعلق بتثبيط نمو الطفيليات داخل الخلايا. كما وصفت، هو بروتوكول حذف الجينات CRISPR-Cas9 المستندة في توكسوبلازما باستخدام 50 منطقة متجانسة bp لإعادة تركيب القائم على homology (HDR). من خلال تحديد فعالية تثبيط LHVS في البرية من نوع وTgCPL (توكسوبلازما cathepsin L مثل البروتياز) الطفيليات ناقصة, وتبين أن LHVS يمنع نمو الطفيليات البرية من نوع أكثر كفاءة من نمو الـ Οcpl, مما يشير إلى أن TgCPL هو الهدف الذي يربط LHVS إلى في توكسوبلازما. حساسية عالية وسهولة التشغيل من هذا السهو على أساس التسمم النمو المنقّعة جعلها مناسبة لرصد انتشار توكسوبلازما وتقييم فعالية الدواء بطريقة إنتاجية عالية.
Introduction
Toxoplasma غوندي هو ناجح للغاية ملزمة الطفيلي داخل الخلايا التي تصيب ما يقرب من ثلث السكان البشرية. ويعزى ارتفاع معدل انتقال العدوى في الغالب إلى طرق انتقاله المتنوعة، بما في ذلك استهلاك اللحوم غير المطبوخة جيدا، والتعرض لخزانات الثدييات، وانتقال العدوى الخلقية أثناء الولادة. T. gondii يسبب أساسا العدوى الانتهازية التي يمكن أن تؤدي إلى اعتلال شديد والوفيات في الأفراد المنقوصةالمناعي1,,2,,3,,4,,5,,6. المضادات الحيوية المستخدمة حاليا لعلاج داء التوكسوبلازمات الحادة غير فعالة بشكل خاص في علاج العدوى الخلقية والكامنة وتسبب ردود فعل شديدة في بعض الأفراد3,7,8. وبالتالي ، هناك حاجة ملحة لتحديد العلاجات الجديدة. فهم الاختلافات في العمليات تحت الخلية داخل توكسوبلازما ومضيفها سوف يساعد على تحديد الأهداف المحتملة للأدوية. لذلك ، هناك حاجة إلى تقنيات فعالة ومريحة للتلاعب بالجينوم لدراسة أدوار الجينات الفردية داخل توكسوبلازما. بالإضافة إلى ذلك، Toxoplasma ينتمي إلى Apicomplexa phylum، الذي يتضمن العديد من مسببات الأمراض البشرية الهامة الأخرى، مثل بلازموديوم spp. وCryptosporidium spp. وبالتالي ، يمكن استخدام Toxoplasma ككائن حي نموذجي للمساعدة في دراسة البيولوجيا الأساسية في الطفيليات المعقدة الأخرى.
لتحديد المضادات الحيوية الجديدة ضد مسببات الأمراض الميكروبية ، يتم إجراء فحص عالي الإنتاجية لمكتبة من المركبات الكيميائية في البداية لتحديد فعاليتها في قمع النمو الميكروبي. حتى الآن وقد وضعت العديد من المقاييس النمو على أساس microplate لقياس النمو داخل الخلايا من T. gondii (أي المشعة 3H-uracil أساس القياس الكمي9، الكشف عن الطفيليات المستندة إلى ELISA الكمية باستخدام T. gondii-الأجسام المضادة محددة10،1114، والقياس القائم على البروتين مراسل باستخدام α-galactosidase أو YFP التعبير عن سلالات Toxoplasma 12،13، وطور مؤخرا عالية المحتوى
ولهذه الاستراتيجيات الفردية مزايا فريدة من نوعها؛ ومع ذلك، بعض القيود أيضاً تقييد تطبيقاتها. على سبيل المثال، بما أن توكسوبلازما لا يمكن أن تتكرر إلا داخل الخلايا الحيوانية النواة، فإن الفلور الفلورية والملزمة غير المحددة للأجسام المضادة المضادة لـT. gondii لاستضافة الخلايا تسبب تداخلًا في القياسات القائمة على الفلورسينس. وعلاوة على ذلك، يتطلب استخدام النظائر المشعة امتثالا خاصا للسلامة ومسائل محتملة تتعلق بالسلامة. بعض هذه الفرضيات هي أكثر ملاءمة لتقييم النمو في نقطة زمنية واحدة بدلا من الرصد المستمر للنمو.
عرض هنا هو بروتوكول على أساس luciferase للقياس الكمي لنمو توكسوبلازما داخل الخلايا. في دراسة سابقة، تم استنساخ جين NanoLuc luciferase تحت مروج توبولولين توكسوبلازما، وهذا البناء التعبير luciferase تم نقلها إلى نوع البرية (RHΟku80ku8سلالةhxg) الطفيليات لإنشاء RHАаku80οhxg:: سلالةNLuc (يشار إليها باسم RHΟku80::NLuc فيما يلي)15. هذه السلالة بمثابة سلالة الوالدين لتحديد النمو داخل الخلايا وحذف الجينات في هذه الدراسة. باستخدام RHΟku80:: سلالةNLuc ، تم رصد نمو الطفيليات في الخلايا الليفية القلفة البشرية (HFFs) على مدى فترة 96 ساعة بعد العدوى لحساب وقت مضاعفة الطفيليات.
بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تحديد فعالية تثبيط LHVS ضد نمو الطفيليات عن طريق رسم معدلات نمو توكسوبلازما مقابل تركيزات LHVS التسلسلية لتحديد قيمة IC50. وقد ذكرت الأدبيات السابقة أن TgCPL هو هدف رئيسي من LHVS في الطفيليات وأن العلاج مع LHVS يقلل من تطور التهابات توكسوبلازما الحادة والمزمنة16,17,18,19. بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام RHΟku80::NLuc كسلالة أبوية لتعديل الجينوم لتوليد سلالة ناقصة TgCPL(RHΟku80cpl::NLuc)،وتم قياس تثبيط LHVS مقابل هذا المتحول. من خلال مراقبة تحول أعلى من قيم IC50 لLHVS في TgCPL-الطفيليات الناقصة مقارنة بسلالة WT ، تم التحقق من أن TgCPL مستهدف من قبل LHVS في الجسم الحي.
في هذا البروتوكول، RHΟku80:: يستخدمNLuc كسلالة الوالدين، والتي تفتقر إلى كفاءة غير متجانسة نهاية الانضمام المسار (NHEJ)، وبالتالي تسهيل المزدوج كروس homology تعتمد على إعادة الجمع (HDR)20،21. بالإضافة إلى ذلك، 50 منطقة متجانسة bp محاطة في كلا طرفي كاسيت مقاومة الأدوية بواسطة PCR. يعمل منتج PCR كقالب إصلاح لإزالة موضع الجينات بأكملها عبر HDR باستخدام أدوات تحرير الجينوم المستندة إلى CRISPR-Cas9. ويمكن دمج هذه المناطق القصيرة المتجانسة بسهولة في الالتمهيديات، مما يوفر استراتيجية مريحة لإنتاج قالب الإصلاح. يمكن تعديل هذا البروتوكول لتنفيذ حذف الجينات العالمية ووضع علامات الجينات الذاتية.
على سبيل المثال ، في أحدث منشور لدينا ، تم تغريب ثلاثة جينات بروتياز ، TgCPL، TgCPB (Toxoplasma cathepsin B-like protease) ، وTgSUB1 (Toxoplasma subtilisin like protease 1) ، تم تغريبها وراثيًا في TgCRT (Toxoplasma chloroquine-resistance الناقل) الطفيليات الناقصة باستخدام هذه الطريقة15. بالإضافة إلى ذلك، TgAMN (a الأمينية المفترضة N [TgAMN, TGGT1_221310]) كان الموسومة داخليا15. وأفاد مختبر لورديو أيضا باستخدام مناطق متجانسة قصيرة في حدود 40-43 نقطة با لإدخال طفرة جينية موجهة من الموقع ووضع علامات الجينات الذاتية في الجينوم توكسوبلازما باستخدام طريقة مماثلة22. تشير هذه التعديلات الناجحة في الجينوم إلى أن منطقة متجانسة 40-50 bp كافية لإعادة تركيب الحمض النووي بكفاءة في سلالة TgKU80-ناقصة ، والتي تبسط إلى حد كبير التلاعب الجينوم في Gondii Toxoplasma.
Protocol
Representative Results
Discussion
++يصف هذا البروتوكول بروتوكولًا قائمًا على اللوكفراز لتقييم نمو توكسوبلازما داخل الخلايا وتقييم فعالية تثبيط المركبات الكيميائية ضد نمو الطفيليات. بالمقارنة مع الاستراتيجيات الحالية المتاحة لقياس نمو توكسوبلازما داخل الخلايا، هذه الطريقة تظهر حساسية عالية وخصوصية عالية. أثن?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفان أن يشكرا الدكتورين سيبلي وكاروثرز على مشاركة pSAG1-Cas9-sgRNA-TgUPRT plasmid وAnti-TgCPL وTgActin. تم دعم هذا العمل من قبل صندوق كليمسون بدء التشغيل (إلى Z.D.) ، فرسان فرسان الطب المنجل مؤسسة طب الأطفال طب العيون الوظيفي مبتدئ منحة البحوث (إلى Z.D.) ، منحة تجريبية من منحة NIH COBRE P20GM109094 (إلى Z.D.) ، وNIH R01AI143707 (إلى Z.D.). لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتحليلها أو قرار نشر المخطوطة أو إعدادها.
Materials
| Agarose gel extraction kit | New England BioLabs | T1020L | |
| BamHI | New England BioLabs | R0316S | |
| Biotek Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader | BioTek Instuments | ||
| BTX Gemini Twin Waveform Electroporation System | Harvard Apparatus | ||
| Chemically competent E. coli cells | New England BioLabs | C29871 | |
| CloneAmp HiFi PCR premix | Takara Bio | 639298 | |
| Coelenterazine h | Prolume | 301-10 hCTZ | |
| EcoRV | New England BioLabs | R3195S | |
| Phire Tissue Direct PCR Master Mix | Thermo Scientific | F170L | |
| Plasmid miniprep kit | Zymo Research | D4054 | |
| Q5 Site-Directed Mutagenesis kit | New England BioLabs | E0554S | |
| Software | |||
| Geneious software for sgRNA design (version: R11) | |||
| GraphPad Prism software (8th version) | |||
| SnapGene for molecular cloning (version: 4.2.11) |
References
- Blader, I. J., Coleman, B. I., Chen, C. T., Gubbels, M. J. Lytic Cycle of Toxoplasma gondii: 15 Years Later. Annual Review of Microbiology. 69 (1), 1-23 (2014).
- Jones, J. L., Kruszon-Moran, D., Rivera, H., Price, C., Wilkins, P. P. Toxoplasma gondii Seroprevalence in the United States 2009-2010 and Comparison with the Past Two Decades. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 90 (6), (2014).
- Kieffer, F., Wallon, M. Congenital toxoplasmosis. Handbook of Clinical Neurology. 112, 1099-1101 (2013).
- Hoffmann, S., Batz, M. B., Morris, G. J. Annual cost of illness and quality-adjusted life year losses in the United States due to 14 foodborne pathogens. Journal of Food Protection. 75 (7), 1292-1302 (2012).
- Dubey, J. Toxoplasmosis. Journal of the American Veterinary Medical Association. 205 (11), 1593-1598 (1994).
- Lindsay, D., Dubey, J. Toxoplasma gondii: the changing paradigm of congenital toxoplasmosis. Parasitology. 138 (14), 1-3 (2011).
- Deng, Y., Wu, T., Zhai, S., Li, C. Recent progress on anti-Toxoplasma drugs discovery: Design, synthesis and screening. European Journal of Medicinal Chemistry. 183, 111711 (2019).
- Butler, N. J., Furtado, J. M., Winthrop, K. L., Smith, J. R. Ocular toxoplasmosis II: clinical features, pathology and management. Clinical & Experimental Ophthalmology. 41 (1), 95-108 (2013).
- Pfefferko, E., Pfefferko, L. C. Specific Labeling of Intracellular Toxoplasma gondii with Uracil. Journal of Eukaryotic Microbiology. 24 (3), 449-453 (1977).
- Merli, A., Canessa, A., Melioli, G. Enzyme immunoassay for evaluation of Toxoplasma gondii growth in tissue culture. Journal of Clinical Microbiology. 21 (1), 88-91 (1985).
- Derouin, F., Chastang, C. Enzyme immunoassay to assess effect of antimicrobial agents on Toxoplasma gondii in tissue culture. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 32 (3), 303-307 (1988).
- McFadden, D., Seeber, F., Boothroyd, J. Use of Toxoplasma gondii expressing beta-galactosidase for colorimetric assessment of drug activity in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (9), 1849-1853 (1997).
- Gubbels, M. J., Li, C., Striepen, B. High-Throughput Growth Assay for Toxoplasma gondii Using Yellow Fluorescent Protein. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (1), 309-316 (2003).
- Touquet, B., et al. High-content imaging assay to evaluate Toxoplasma gondii infection and proliferation: A multiparametric assay to screen new compounds. PLoS ONE. 13 (8), e0201678 (2018).
- Thornton, L. B., et al. An ortholog of Plasmodium falciparum chloroquine resistance transporter (PfCRT) plays a key role in maintaining the integrity of the endolysosomal system in Toxoplasma gondii to facilitate host invasion. PLOS Pathogens. 15 (6), e1007775 (2019).
- Larson, E. T., et al. Toxoplasma gondii cathepsin L is the primary target of the invasion-inhibitory compound morpholinurea-leucyl-homophenyl-vinyl sulfone phenyl. The Journal of Biological Chemistry. 284 (39), 26839-26850 (2009).
- Dou, Z., McGovern, O. L., Cristina, M., Carruthers, V. B. Toxoplasma gondii Ingests and Digests Host Cytosolic Proteins. mBio. 5 (4), e01188-14 (2014).
- Cristina, M., et al. Toxoplasma depends on lysosomal consumption of autophagosomes for persistent infection. Nature Microbiology. 2, 17096 (2017).
- Parussini, F., Coppens, I., Shah, P. P., Diamond, S. L., Carruthers, V. B. Cathepsin L occupies a vacuolar compartment and is a protein maturase within the endo/exocytic system of Toxoplasma gondii. Molecular Microbiology. 76 (6), 1340-1357 (2010).
- Huynh, M. H., Carruthers, V. B. Tagging of endogenous genes in a Toxoplasma gondii strain lacking Ku80. Eukaryotic cell. 8 (4), 530-539 (2009).
- Fox, B. A., Ristuccia, J. G., Gigley, J. P., Bzik, D. J. Efficient gene replacements in Toxoplasma gondii strains deficient for nonhomologous end joining. Eukaryotic Cell. 8 (4), 520-529 (2009).
- Sidik, S. M., Hackett, C. G., Tran, F., Westwood, N. J., Lourido, S. Efficient Genome Engineering of Toxoplasma gondii Using CRISPR/Cas9. PLoS ONE. 9 (6), e100450 (2014).
- Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, D. L. Efficient Gene Disruption in Diverse Strains of Toxoplasma gondii Using CRISPR/CAS9. mBio. 5 (3), e01114-14 (2014).
- Radke, J. R., et al. Defining the cell cycle for the tachyzoite stage of Toxoplasma gondii. Molecular and Biochemical Parasitology. 115 (2), 165-175 (2001).
- Ran, A. F., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Research. 44 (W1), W272-W276 (2016).
- Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nature Methods. 11 (2), 2812 (2014).
- Peng, D., Tarleton, R. EuPaGDT: a web tool tailored to design CRISPR guide RNAs for eukaryotic pathogens. Microbial Genomics. 1 (4), e000033 (2015).
- Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
- Sidik, S. M., et al. A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes. Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).
