Summary

Test d’immunohistochimie pour la détection de l’antigène du lyssavirus à partir de tissus fixés au for formel

Published: October 26, 2021
doi:

Summary

Nous présentons ici un protocole de test d’immunohistochimie pour la détection de l’antigène du virus de la rage en tant que test de diagnostic alternatif pour les tissus fixés au for formel.

Abstract

L’une des principales modalités de diagnostic de la rage est la détection du complexe viral de ribonucléoprotéines (RNP) (antigène) dans les échantillons de tissus infectés. Bien que le test d’anticorps fluorescents directs (DFA) ou le test immunohistochimique rapide direct (DRIT) soient le plus souvent utilisés pour la détection de l’antigène, les deux tests nécessitent des tissus frais et / ou congelés pour les empreintes sur les lames avant la détection de l’antigène à l’aide d’anticorps. Si les échantillons sont prélevés et fixés dans du for formel, aucun des deux tests n’est optimal pour la détection de l’antigène, cependant, les tests peuvent être effectués par immunohistochimie conventionnelle (IHC) après intégration dans des blocs de paraffine et sectionnement. Avec cette méthode IHC, les tissus sont colorés avec des anticorps antirabiques, les sections sont déparaffinisées, l’antigène récupéré par protéolyse partielle ou d’autres méthodes, et incubé avec des anticorps primaires et secondaires. Les antigènes sont colorés à l’aide de peroxydase de raifort / carbazole d’éthyle aminé et contre-colorés avec de l’hématoxyline pour la visualisation à l’aide d’un microscope optique. En plus de la détection spécifique de l’antigène, la fixation du formoin offre d’autres avantages tels que la détermination des changements histologiques, des conditions détendues pour le stockage et le transport des échantillons (à température ambiante), la possibilité de tester des cas rétrospectifs et l’amélioration de la sécurité biologique grâce à l’inactivation d’agents infectieux.

Introduction

La rage est une encéphalite progressive aiguë causée par les virus à ARN à sens négatif appartenant au genre lyssavirus1. Près de 99% de tous les décès humains causés par l’infection par le virus de la rage (RABV), le type membre du genre, sont transmis par les chiens2. Le diagnostic de la rage chez les animaux suspects repose sur la détection d’antigènes (principalement des nucléoprotéines codées virales, protéine N) en complexe avec de l’ARN génomique (complexe ribonucléoprotéique, RNP) dans le tissu cérébral3. La détection de l’antigène par le test d’anticorps fluorescents directs (DFA) est considérée comme l’étalon-or pour le diagnostic de la rage4. La méthode utilise du matériel cérébral congelé frais ou frais, une empreinte tactile sur une lame, une fixation dans l’acétone, une coloration à l’aide d’anticorps monoclonaux ou polyclonaux marqués à l’isothiocyanate fluorescent (FITC) disponibles dans le commerce (mAbs / pAbs) et lus par la microscopie à fluorescence5. Le test DFA est rapide, sensible et spécifique à la détection de l’antigène de la rage dans les tissus cérébraux frais. Récemment, il a été démontré qu’un test immunohistochimique rapide direct (DRIT), une technique d’immunohistochimie modifiée (IHC), présentait une sensibilité similaire à celle du DFA, mais offre l’avantage de la microscopie optique pour la visualisation6. Bien que la méthode de détection utilisée dans le DRIT soit similaire à l’IHC, l’étape initiale utilise des tissus frais ou congelés pour générer des empreintes tactiles de l’échantillon, suivies d’une fixation dans du formain.

L’IHC est une technique largement utilisée pour déterminer les changements histologiques et la détection des protéines à l’aide d’anticorps spécifiques dans des tissus fixés au for formel incorporés dans des blocs de paraffine. L’IHC est un test alternatif établi pour la détection de l’antigène de la rage dans les coupes tissulaires7. L’IHC a été particulièrement utilisé pour le diagnostic des cas rétrospectifs présentant des maladies neurologiques afin de déterminer le fardeau de la rage8. Les tissus fixés au for formel incorporés dans la paraffine préservent les protéines pour la détection même après plusieurs années lorsqu’ils sont stockés à température ambiante9. Le traitement au forme modifie les protéines en réticulant et en modifiant les chaînes latérales des acides aminés, ce qui pourrait rendre les épitopes non réactifs contre les anticorps10. Alors que le test IHC pour la détection de l’antigène de la rage implique soit mAbs, soit pAbs, ce dernier est avantageux car plusieurs épitopes et lyssavirus divergents peuvent être détectés11.

Les étapes standard impliquées dans l’IHC sont la fixation des tissus par forgé, l’incorporation dans des blocs de paraffine, la section des tissus, la déparaffinisation et l’hydratation, la récupération de l’épitope, la réactivité contre les anticorps primaires et secondaires et le développement à l’aide de substrats chromogènes. Ce manuscrit décrit un compte rendu détaillé du protocole de diagnostic de la rage. Pour la détection de l’antigène de la rage, le sérum de souris immunisé avec le RABV (pAbs) généré aux Centers for Disease Control and Prevention (CDC) des États-Unis à Atlanta, en Géorgie, en combinaison avec des anticorps secondaires biotinylés anti-souris est utilisé. Les abdominaux biotinylés sont détectés par l’ajout du complexe streptavidine-peroxydase de raifort (HRP) suivi du développement de la couleur avec un substrat d’amino-éthylcarbazole.

Protocol

Bien que le protocole IHC ait été effectué sur des tissus fixés au for formel, qui inactivent le RABV s’il est présent, les protocoles de biosécurité appropriés doivent être correctement suivis. Toutes les procédures de biosécurité sont décrites dans la 5e édition (https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm) de La biosécurité dans les laboratoires microbiologiques et biomédicaux (BMBL), y compris le port d’un équipement de protection individuelle (EPI) approprié et l’exigence de v…

Representative Results

La figure 2 montre les résultats représentatifs de coloration IHC d’échantillons témoins positifs et négatifs dans différents tissus cérébraux testés. La figure 2A, D, G représente des échantillons positifs à 200x, tandis que la figure 2B, E, H correspond à un grossissement de 400x, respectivement. Figure 2A-C</str…

Discussion

En raison du taux élevé de mortalité de la rage après l’apparition des symptômes, le diagnostic d’animaux suspects d’infection par le RABV est extrêmement critique pour un traitement prophylactique post-exposition approprié. Le diagnostic de la rage dépend principalement des techniques basées sur le DFA, le DRIT et la PCR utilisant des tissus frais ou congelés. Pour tester les tissus fixés au for formel, le test IHC fournit une méthode alternative pour la détection sensible et spécifique de l’antig?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions les laboratoriens, les épidémiologistes et les affiliés des départements de santé publique pour les soumissions d’échantillons aux Centers for Disease Control and Prevention. Les résultats et conclusions de ce rapport sont ceux des auteurs et ne représentent pas nécessairement la position officielle des Centers for Disease Control and Prevention. L’utilisation de noms commerciaux et de sources commerciales est uniquement à des fins d’identification et n’implique pas l’approbation par les Centers for Disease Control and Prevention.

Materials

3% hydrogen peroxide Pharamacy brands Off the shelf 3% H2O2
3-Amino-9-ethylcarbazole (AEC) Millipore Sigma A6926
Acetate Buffer pH 5.2 Poly Scientific R&D Corp. s140
Buffered Formalin 10% Phosphate Buffered Fisher Scientific SF100-4 Certified
Cover slips Corning Fisher Scientific 12-553-471 24 X 50 mm
Ethanol 190 Proof Pharmco-AAPER 111000190
Ethanol 200 Proof Pharmco-AAPER 111000200
Gill's hematoxylin formulation #2 Fisher Scientific CS401-1D
HistoMark Biotin-Streptavidin Peroxidase Kit seracare 71-00-18 Mouse Primary Antibody 
ImmunoHistoMount Millipore Sigma i1161 Mounting media
N,N, Dimethyl formamide GR Fisher Scientific D119
Phosphate Buffered Saline  HyClone RR14440.01 01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6)
Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 Objective Multiple vendors
Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Objective Multiple vendors
Pronase Millipore Sigma 53702 Protease, Streptomyces griseus
Scott's Tap Water  Poly Scientific R&D Corp. s1887
Tissue-Tek Slide stain set Fisher Scientific 50-294-72
TWEEN-80  Millipore Sigma P1754
Xylene Fisher Scientific X3S-4 Histological Grade
Zeiss Axioplan 2 imaging – microscope Multiple vendors

References

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Cite This Article
Niezgoda, M., Subbian Satheshkumar, P. Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues. J. Vis. Exp. (176), e60138, doi:10.3791/60138 (2021).

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