בדיקת אימונוהיסטוכימיה לגילוי אנטיגן ליסוירוס מרקמות קבועות פורמלין
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול בדיקת אימונוהיסטוכימיה לגילוי אנטיגן וירוס כלבת כמבחן אבחון חלופי לרקמות קבועות פורמרין.
Abstract
אחת מאפשרויות האבחון העיקריות לכלבת היא זיהוי של קומפלקס ריבונוקליאופרוטאין ויראלי (RNP) (אנטיגן) בדגימות הרקמה הנגועות. בעוד שבדיקת הנוגדן הפלואורסצנטי הישיר (DFA) או הבדיקה האימונוהיסטוכימית המהירה הישירה (DRIT) משמשות בדרך כלל לגילוי אנטיגן, שתי הבדיקות דורשות רקמות טריות ו/או קפואות להתרשמות בשקופיות לפני גילוי האנטיגן באמצעות נוגדנים. אם דגימות נאספות ומתוקנות בפורמלין, אף אחת מהבדיקה אינה אופטימלית לזיהוי אנטיגן, עם זאת, הבדיקות יכולות להתבצע על ידי אימונוהיסטוכימיה קונבנציונלית (IHC) לאחר הטמעה בבלוקים ופרפין וחתך. בשיטת IHC זו, רקמות מוכתמות בנוגדנים נגד כלבת, חלקים הם deparaffinized, אנטיגן אחזור על ידי פרוטאוליזה חלקית או שיטות אחרות, ודגורה עם נוגדנים ראשוניים ומשניים. אנטיגנים מוכתמים באמצעות peroxidase חזרת / אמינו אתיל קרבזול ומוכתם עם המטוקסילין להדמיה באמצעות מיקרוסקופ אור. בנוסף לגילוי אנטיגן ספציפי, קיבוע פורמלין מציע יתרונות אחרים כמו קביעת שינויים היסתולוגיים, תנאים רגועים לאחסון ותובלה של דגימה (בטמפרטורות הסביבה), יכולת לבדוק מקרים רטרוספקטיביים ובטיחות ביולוגית משופרת באמצעות אי-החלמה של חומרים זיהומיים.
Introduction
כלבת היא דלקת המוח מתקדמת חריפה הנגרמת על ידי וירוסי RNA תחושה שלילית השייכים לסוג lyssavirus1. כמעט 99% מכלל מקרי המוות האנושיים הנגרמים על ידי זיהום בנגיף הכלבת (RABV), סוג הסוג, מועבר על ידי כלבים2. אבחון כלבת של בעלי חיים חשודים מסתמך על גילוי אנטיגן (בעיקר נוקלאופרוטאין מקודד ויראלי, חלבון N) בקומפלקס עם RNA גנומי (קומפלקס ריבונוקליאופרוטאין, RNP) ברקמת המוח3. גילוי אנטיגן על ידי בדיקת נוגדן פלואורסצנטי ישיר (DFA) נחשב תקן הזהב לאבחון כלבת4. השיטה משתמשת בחומר מוח קפוא טרי או טרי, רושם מגע על שקופית, קיבוע אצטון, כתמים באמצעות איזוטיוציאנט פלואורסצנטי זמין מסחרית (FITC) שכותרתו נוגדנים חד שבטיים או פוליקלונליים (mAbs / pAbs) ונקרא על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית5. בדיקת DFA מהירה, רגישה וספציפית לזיהוי אנטיגן כלבת ברקמת מוח טרייה. לאחרונה, בדיקה אימונוהיסטוכימית מהירה ישירה (DRIT), טכניקה אימונוהיסטוכימיה שונה (IHC), הודגמה להפגין רגישות דומה DFA אבל מציע את היתרון של מיקרוסקופיה אור להדמיה6. בעוד שיטת הזיהוי המשמשת DRIT, דומה IHC, השלב הראשוני משתמש ברקמות טריות או קפואות כדי ליצור רשמי מגע של המדגם ואחריו קיבעון פורמלין.
IHC היא טכניקה נפוצה לקביעת שינויים היסתולוגיים וזיהוי חלבונים באמצעות נוגדנים ספציפיים ברקמות קבועות פורמלין המוטמעות בלוקים פרפין. IHC הוא בדיקה חלופית הוקמה לגילוי אנטיגן כלבת בסעיפים7רקמה . IHC נוצל במיוחד לאבחון מקרים רטרוספקטיביים שהפגינו מחלות נוירולוגיות כדי לקבוע את נטל הכלבת8. רקמות קבועות פורמרין מוטבעות פרפין לשמר את החלבונים לגילוי גם לאחר מספר שנים כאשר מאוחסנים בטמפרטורתהסביבה 9. טיפול פורמלין משנה חלבונים על ידי הצלבה ושינוי שרשראות הצד של חומצות האמינו, מה שעלול לגרום לאפיטופים כבר לא להגיב נגד נוגדנים10. בעוד שבדיקת IHC לזיהוי אנטיגן נגד כלבת כוללת mAbs או pAbs, האחרון הוא יתרון כמו epitopes מרובים ו lyssaviruses מפוצלים ניתן לזהות11.
השלבים הסטנדרטיים המעורבים ב- IHC הם קיבוע פורמלין של רקמות, הטמעה בבלוקים פרפין, חלוקת רקמות, דפראפיזציה והידרציה, התאוששות אפיטופה, תגובתיות נגד נוגדנים ראשוניים ומשניים, והתפתחות באמצעות מצעים כרומוגניים. כתב יד זה מתאר תיאור מפורט של הפרוטוקול לאבחון כלבת. לגילוי אנטיגן כלבת, סרום עכבר מחוסן עם RABV (pAbs) המיוצר במרכזים לבקרת מחלות ומניעתן בארה”ב (CDC) אטלנטה, ג’ורג’יה, בשילוב עם נוגדנים משניים נגד עכבר ביוטיניל מנוצלים. שרירי בטן ביוטינילאט מזוהים על ידי תוספת של קומפלקס peroxidase סטרפטאבידין-חזרת (HRP) ואחריו התפתחות הצבע עם מצע אמינו-אתילקרבאזול.
Protocol
Representative Results
Discussion
בשל שיעור התמותה הגבוה של כלבת לאחר הופעת הסימפטום, האבחנה של בעלי חיים חשודים לזיהום RABV היא קריטית ביותר לטיפול מניעתי מתאים לאחר חשיפה. אבחון כלבת תלוי בעיקר בטכניקות DFA, DRIT ו- PCR באמצעות רקמות טריות או קפואות. לבדיקת רקמות קבועות פורמרין, בדיקת IHC מספקת שיטה חלופית לזיהוי רגיש וספציפי של א…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למעבדות, לאפידמיולוגים ולשותפים עם מחלקות בריאות הציבור על הגשת מדגמים למרכז לבקרת מחלות ומניעתן. הממצאים והמסקנות בדו”ח זה הם של המחברים ואינם מייצגים בהכרח את עמדתם הרשמית של המרכז לבקרת מחלות ומניעתן. השימוש בשמות מסחריים ומקורות מסחריים מיועד לזיהוי בלבד ואינו מרמז על תמיכה על ידי המרכז לבקרת מחלות ומניעתן.
Materials
| 3% hydrogen peroxide | Pharamacy brands | Off the shelf 3% H2O2 | |
| 3-Amino-9-ethylcarbazole (AEC) | Millipore Sigma | A6926 | |
| Acetate Buffer pH 5.2 | Poly Scientific R&D Corp. | s140 | |
| Buffered Formalin 10% Phosphate Buffered | Fisher Scientific | SF100-4 | Certified |
| Cover slips Corning | Fisher Scientific | 12-553-471 | 24 X 50 mm |
| Ethanol 190 Proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol 200 Proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Gill's hematoxylin formulation #2 | Fisher Scientific | CS401-1D | |
| HistoMark Biotin-Streptavidin Peroxidase Kit | seracare | 71-00-18 | Mouse Primary Antibody |
| ImmunoHistoMount | Millipore Sigma | i1161 | Mounting media |
| N,N, Dimethyl formamide GR | Fisher Scientific | D119 | |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone | RR14440.01 | 01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6) |
| Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 Objective | Multiple vendors | ||
| Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Objective | Multiple vendors | ||
| Pronase | Millipore Sigma | 53702 | Protease, Streptomyces griseus |
| Scott's Tap Water | Poly Scientific R&D Corp. | s1887 | |
| Tissue-Tek Slide stain set | Fisher Scientific | 50-294-72 | |
| TWEEN-80 | Millipore Sigma | P1754 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3S-4 | Histological Grade |
| Zeiss Axioplan 2 imaging – microscope | Multiple vendors |
References
- Rupprecht, C., Kuzmin, I., Meslin, F. Lyssaviruses and rabies: current conundrums, concerns, contradictions and controversies. F1000Research. 6, 184 (2017).
- Fooks, A. R., et al. Current status of rabies and prospects for elimination. Lancet. 384 (9951), 1389-1399 (2014).
- Finke, S., Brzozka, K., Conzelmann, K. K. Tracking fluorescence-labeled rabies virus: enhanced green fluorescent protein-tagged phosphoprotein P supports virus gene expression and formation of infectious particles. Journal of Virology. 78 (22), 12333-12343 (2004).
- WHO. WHO Expert Consulation on Rabies, Third Report. WHO Technical Report Series. 1012, 1 (2018).
- Goldwasser, R. A., Kissling, R. E. Fluorescent antibody staining of street and fixed rabies virus antigens. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 98 (2), 219-223 (1958).
- Lembo, T., et al. Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis. Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).
- Fekadu, M., Greer, P. W., Chandler, F. W., Sanderlin, D. W. Use of the avidin-biotin peroxidase system to detect rabies antigen in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Journal of Virological Methods. 19 (2), 91-96 (1988).
- Hamir, A. N., Moser, G., Rupprecht, C. E. A five year (1985-1989) retrospective study of equine neurological diseases with special reference to rabies. Journal of Comparative Pathology. 106 (4), 411-421 (1992).
- Inoue, S., et al. Cross-reactive antigenicity of nucleoproteins of lyssaviruses recognized by a monospecific antirabies virus nucleoprotein antiserum on paraffin sections of formalin-fixed tissues. Pathology International. 53 (8), 525-533 (2003).
- Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
- Feiden, W., et al. Immunohistochemical staining of rabies virus antigen with monoclonal and polyclonal antibodies in paraffin tissue sections. Zentralblatt fur Veterinarmedizin Reihe B. 35 (4), 247-255 (1988).
- Manning, S. E., et al. Human rabies prevention–United States, 2008: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices. Morbidity and Mortality Weekly Reports Recommendations and Reports. 57, 1-28 (2008).
- WHO. . Laboratory techniques in rabies. 1, 67-72 (2018).
- Patrick, E. M., et al. Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test. Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).
- Whitfield, S. G., et al. A comparative study of the fluorescent antibody test for rabies diagnosis in fresh and formalin-fixed brain tissue specimens. Journal of Virology Methods. 95 (1-2), 145-151 (2001).
- WHO. . Diagnostic procedures for antigen detection. , (2016).
- Jarvis, J. A., Franke, M. A., Davis, A. D. Rabies direct fluorescent antibody test does not inactivate rabies or eastern equine encephalitis viruses. Journal of Virology Methods. 234, 52-53 (2016).
