从正式固定组织检测利沙病毒抗原的免疫化学测试
Summary
在这里，我们提出了一个免疫造血测试协议，用于检测狂犬病病毒抗原，作为正式固定组织的替代诊断测试。
Abstract
狂犬病的主要诊断方式之一是在受感染的组织样本中检测病毒核糖核蛋白（RNP）复合物（抗原）。虽然直接荧光抗体 （DFA） 测试或直接快速免疫组织化学测试 （DRIT） 最常用于抗原检测，但两项测试都需要新鲜和/或冷冻组织，以便在使用抗原检测之前在幻灯片上留下印象。如果样品被收集并固定在正式素中，则两种测试都不是抗原检测的最佳方法，但是，在嵌入石蜡块和切片后，常规免疫造血术 （IHC） 可以进行测试。使用这种IHC方法，组织被抗狂犬病抗体染色，部分被去帕拉芬化，抗原通过部分蛋白解或其他方法检索，并孵育为一级和二级抗体。抗原使用马萝卜过氧化酶/氨基乙基卡巴佐尔染色，并用血氧素进行反污，以便使用光显微镜进行可视化。除了特定的抗原检测外，形式固定还具有其他优势，如确定组织学变化、放宽标本储存和运输条件（在环境温度下）、检测追溯性病例的能力以及通过灭活感染剂提高生物安全性。
Introduction
狂犬病是由属于利萨病毒1属的负感RNA病毒引起的急性渐进性脑炎。近99%的人类死亡是由狂犬病病毒（RABV）感染引起的，狂犬病病毒是该属的类型成员，由狗2传播。疑似动物的狂犬病诊断依赖于在脑组织3中与基因组RNA（核蛋白复合物，RNP）复合体中检测抗原（主要是病毒编码核蛋白，N蛋白）。直接荧光抗体（DFA）检测的抗原被认为是狂犬病诊断的黄金标准。该方法利用新鲜或新鲜的冷冻脑物质，在幻灯片上的触摸印象，固定在丙酮，染色使用商业上可用的荧光异氰酸酯（FITC）标记单克隆或多克隆抗体（mAbs/pAbs），并通过荧光显微镜5读取。DFA 测试对于新鲜脑组织中的狂犬病抗原检测是快速、敏感和特定的。最近，一种直接的快速免疫化学测试（DRIT），改良免疫造血（IHC）技术，被证明表现出类似的敏感性DFA，但提供了光显微镜的可视化6的优势。虽然 DRIT 中使用的检测方法与 IHC 类似，但初始步骤利用新鲜或冷冻组织生成样品的触摸印象，然后固定在形式素中。
IHC是一种广泛使用的技术，用于确定组织学变化和检测蛋白质使用特定抗体在正式固定组织嵌入石蜡块。IHC是组织7部分狂犬病抗原检测的既定替代测试。IHC已特别用于诊断出现神经系统疾病的回顾性病例，以确定狂犬病的负担8。石蜡嵌入的正式固定组织保存蛋白质进行检测，即使几年后储存在环境温度9。形式素处理通过交叉连接和改变氨基酸侧链来改变蛋白质，这可能使表位不再对抗体10产生反应。虽然狂犬病抗原检测的IHC测试涉及mAbs或pAbs，后者是有利的，因为多个表位和不同的利沙病毒可以检测11。
IHC 所涉及的标准步骤是组织正式固定、嵌入石蜡块、组织分割、去帕拉芬化和水化、表位恢复、对初级和二级抗体的反应，以及使用染色基板开发。这份手稿详细描述了狂犬病诊断方案。对于狂犬病抗原检测，使用美国疾病控制和预防中心 （CDC） 在佐治亚州亚特兰大产生的带有 RABV （pAbs） 的鼠血清，并结合生物镀金化抗鼠二级抗体进行免疫。生物素化腹肌通过添加链球菌素-马萝卜过氧化酶（HRP）复合物（HRP）来检测，然后通过氨基-乙基卡巴佐尔基质进行颜色开发来检测。
Protocol
Representative Results
Discussion
由于症状发病后狂犬病死亡率高，对疑似动物的RABV感染诊断对于适当的暴露后预防治疗极为关键。狂犬病的诊断主要取决于使用新鲜或冷冻组织的DFA、DRIT和基于PCR的技术。对于正式固定组织的测试，IHC 测试为 RABV 抗原的敏感和特定检测提供了替代方法。虽然固定在甲醛中的组织由于侧链（如交叉链接）的改变而稳定了蛋白质，但样品需要在抗原检测之前进行处理。在本协议中，通过蛋白酶（例?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢实验室成员、流行病学家以及公共卫生部门的附属机构向疾病控制和预防中心提交样本。本报告的结论和结论是作者的，不一定代表疾病控制和预防中心的官方立场。使用商号和商业来源仅供识别，并不意味着得到疾病控制和预防中心的认可。
Materials
| 3% hydrogen peroxide | Pharamacy brands | Off the shelf 3% H2O2 | |
| 3-Amino-9-ethylcarbazole (AEC) | Millipore Sigma | A6926 | |
| Acetate Buffer pH 5.2 | Poly Scientific R&D Corp. | s140 | |
| Buffered Formalin 10% Phosphate Buffered | Fisher Scientific | SF100-4 | Certified |
| Cover slips Corning | Fisher Scientific | 12-553-471 | 24 X 50 mm |
| Ethanol 190 Proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol 200 Proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Gill's hematoxylin formulation #2 | Fisher Scientific | CS401-1D | |
| HistoMark Biotin-Streptavidin Peroxidase Kit | seracare | 71-00-18 | Mouse Primary Antibody |
| ImmunoHistoMount | Millipore Sigma | i1161 | Mounting media |
| N,N, Dimethyl formamide GR | Fisher Scientific | D119 | |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone | RR14440.01 | 01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6) |
| Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 Objective | Multiple vendors | ||
| Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Objective | Multiple vendors | ||
| Pronase | Millipore Sigma | 53702 | Protease, Streptomyces griseus |
| Scott's Tap Water | Poly Scientific R&D Corp. | s1887 | |
| Tissue-Tek Slide stain set | Fisher Scientific | 50-294-72 | |
| TWEEN-80 | Millipore Sigma | P1754 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3S-4 | Histological Grade |
| Zeiss Axioplan 2 imaging – microscope | Multiple vendors |
References
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