Formalin-Sabit Dokulardan Lyssavirüs Antijen Tespiti için İmmünohistokiniti Testi
Summary
Burada formalin-sabit dokular için alternatif tanı testi olarak kuduz virüsü antijeninin tespiti için immünhistokinemya test protokolü sunuyoruz.
Abstract
Kuduz için birincil tanı yöntemlerinden biri, enfekte doku örneklerinde viral ribonikleoprotein (RNP) kompleksinin (antijen) saptanmasıdır. Antijen tespiti için doğrudan floresan antikor (DFA) testi veya doğrudan hızlı immünohistokimyasal test (DRIT) en yaygın olarak kullanılırken, her iki test de antikorlar kullanılarak antijen tespit edilmeden önce slaytlardaki gösterimler için taze ve/veya dondurulmuş dokular gerektirir. Örnekler formalin içinde toplanır ve sabitlenirse, her iki test de antijen tespiti için uygun değildir, ancak test parafin bloklarına ve kesitlere gömüldikten sonra geleneksel immünhistokimya (IHC) tarafından yapılabilir. Bu IHC yöntemi ile dokular anti-kuduz antikorları ile lekelenir, bölümler deparaffinize edilir, kısmi proteoliz veya diğer yöntemlerle antijen alınır ve primer ve sekonder antikorlarla inkübe edilir. Antijenler yaban turpu peroksidaz / amino etil karbazol kullanılarak lekelenir ve hafif bir mikroskop kullanılarak görselleştirme için hematoksilin ile karşıtır. Spesifik antijen tespitine ek olarak, formalin fiksasyonu histolojik değişikliklerin belirlenmesi, numune depolama ve taşıma için rahat koşullar (ortam sıcaklıkları altında), retrospektif vakaları test etme yeteneği ve enfeksiyöz ajanların inaktivasyonu yoluyla biyolojik güvenliğin iyileştirilmesi gibi başka avantajlar sunar.
Introduction
Kuduz, lyssavirus cinsine ait negatif duyu RNA virüslerinin neden olduğu akut ilerleyici bir ensefalittir1. Cinsin tip üyesi kuduz virüsü (RABV) enfeksiyonundan kaynaklanan tüm insan ölümlerinin yaklaşık% 99’u köpekler tarafından bulaşır2. Şüpheli hayvanların kuduz tanısı, beyin dokusunda genomik RNA (ribonikoprotein kompleksi, RNP) ile komplekste antijenin (öncelikle viral kodlanmış nükleoprotein, N proteini) tespit edilmesine dayanır3. Doğrudan floresan antikor (DFA) testi ile antijen tespiti kuduz tanısı için altın standart olarak kabul edilir4. Yöntemde taze veya taze dondurulmuş beyin materyali, slayt üzerinde dokunma izlenimi, asetonda fiksasyon, ticari olarak mevcut floresan izotiyosiyanat (FITC) etiketli monoklonal veya poliklonal antikorlar (mAbs/pAbs) kullanılarak boyama ve floresan mikroskopisi tarafından okunur5. DFA testi hızlı, hassas ve taze beyin dokusunda kuduz antijen tespiti için özeldir. Son zamanlarda, doğrudan hızlı immünohistokimyasal test (DRIT), modifiye immünhistokimya (IHC) tekniğinin DFA’ya benzer hassasiyet gösterdiği gösterilmiştir, ancak görselleştirme için ışık mikroskopisi avantajı sunmaktadır6. DRIT’de kullanılan algılama yöntemi IHC’ye benzer olsa da, ilk adımda numunenin dokunma izlenimlerini oluşturmak için taze veya dondurulmuş dokular ve ardından formalin fiksasyonu kullanılır.
IHC, parafin bloklarına gömülü formalin-sabit dokularda spesifik antikorlar kullanarak histolojik değişiklikleri ve proteinlerin tespitini belirlemek için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. IHC, doku bölümlerinde kuduz antijen tespiti için belirlenmiş bir alternatif testtir7. IHC özellikle kuduz yükünü belirlemek için nörolojik hastalıklar sergileyen retrospektif vakaların tanısı için kullanılmıştır8. Parafin gömülü formalin sabit dokular, ortam sıcaklığında depolandığında birkaç yıl sonra bile proteinleri tespit için korur9. Formalin tedavisi, amino asit yan zincirlerini çapraz bağlayarak ve değiştirerek proteinleri değiştirir, bu da epitopların antikorlara karşı artık reaktif olmamasını sağlayabilir10. Kuduz antijen tespiti için IHC testi mAbs veya pAbs içerirken, ikincisi birden fazla epitop ve farklı lyssavirüsler tespit edilebildiğinden avantajlıdır11.
IHC’de yer alan standart adımlar dokuların formalin sabitlenmesi, parafin bloklarına gömülmesi, dokuların bölümlenmesi, deparaffinizasyon ve hidrasyon, epitop iyileşmesi, birincil ve ikincil antikorlara karşı reaktivite ve kromojenik substratlar kullanılarak gelişimdir. Bu makalede kuduz tanısı için protokolün ayrıntılı bir anlatımı açıklanmaktadır. Kuduz antijen tespiti için, ABD Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri (CDC) Atlanta, Georgia’da biyotinillenmiş fare karşıtı ikincil antikorlarla birlikte üretilen RABV (pAbs) ile aşılanmış fare serumu kullanılmaktadır. Biyotinilasyonlu Abs, streptavidin-yaban turpu peroksidaz (HRP) kompleksinin eklenmesi ve ardından amino-etilkarbazol substratı ile renk gelişimi ile tespit edilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Semptom başlangıcından sonra kuduzun yüksek ölüm oranı nedeniyle, RABV enfeksiyonu için şüpheli hayvanların tanısı uygun bir maruziyet sonrası profilaktik tedavi için son derece kritiktir. Kuduz tanısı öncelikle taze veya dondurulmuş dokular kullanılarak DFA, DRIT ve PCR tabanlı tekniklere bağlıdır. Formalin-sabit dokuların test edilmesi için, IHC testi RABV antijeninin hassas ve spesifik tespiti için alternatif bir yöntem sağlar. Formalin ile sabitlenen dokular çapraz bağlama gibi yan zinc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Laboratuvar uzmanlarına, epidemiyologlara ve halk sağlığı departmanlarına bağlı kuruluşlara Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezlerine örnek gönderimler için teşekkür ederiz. Bu rapordaki bulgular ve sonuçlar yazarların bulgularıdır ve mutlaka Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezlerinin resmi konumunu temsil etmez. Ticari isimlerin ve ticari kaynakların kullanımı yalnızca tanımlama içindir ve Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri tarafından onay anlamına gelir.
Materials
| 3% hydrogen peroxide | Pharamacy brands | Off the shelf 3% H2O2 | |
| 3-Amino-9-ethylcarbazole (AEC) | Millipore Sigma | A6926 | |
| Acetate Buffer pH 5.2 | Poly Scientific R&D Corp. | s140 | |
| Buffered Formalin 10% Phosphate Buffered | Fisher Scientific | SF100-4 | Certified |
| Cover slips Corning | Fisher Scientific | 12-553-471 | 24 X 50 mm |
| Ethanol 190 Proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol 200 Proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Gill's hematoxylin formulation #2 | Fisher Scientific | CS401-1D | |
| HistoMark Biotin-Streptavidin Peroxidase Kit | seracare | 71-00-18 | Mouse Primary Antibody |
| ImmunoHistoMount | Millipore Sigma | i1161 | Mounting media |
| N,N, Dimethyl formamide GR | Fisher Scientific | D119 | |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone | RR14440.01 | 01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6) |
| Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 Objective | Multiple vendors | ||
| Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Objective | Multiple vendors | ||
| Pronase | Millipore Sigma | 53702 | Protease, Streptomyces griseus |
| Scott's Tap Water | Poly Scientific R&D Corp. | s1887 | |
| Tissue-Tek Slide stain set | Fisher Scientific | 50-294-72 | |
| TWEEN-80 | Millipore Sigma | P1754 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3S-4 | Histological Grade |
| Zeiss Axioplan 2 imaging – microscope | Multiple vendors |
References
- Rupprecht, C., Kuzmin, I., Meslin, F. Lyssaviruses and rabies: current conundrums, concerns, contradictions and controversies. F1000Research. 6, 184 (2017).
- Fooks, A. R., et al. Current status of rabies and prospects for elimination. Lancet. 384 (9951), 1389-1399 (2014).
- Finke, S., Brzozka, K., Conzelmann, K. K. Tracking fluorescence-labeled rabies virus: enhanced green fluorescent protein-tagged phosphoprotein P supports virus gene expression and formation of infectious particles. Journal of Virology. 78 (22), 12333-12343 (2004).
- WHO. WHO Expert Consulation on Rabies, Third Report. WHO Technical Report Series. 1012, 1 (2018).
- Goldwasser, R. A., Kissling, R. E. Fluorescent antibody staining of street and fixed rabies virus antigens. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 98 (2), 219-223 (1958).
- Lembo, T., et al. Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis. Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).
- Fekadu, M., Greer, P. W., Chandler, F. W., Sanderlin, D. W. Use of the avidin-biotin peroxidase system to detect rabies antigen in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Journal of Virological Methods. 19 (2), 91-96 (1988).
- Hamir, A. N., Moser, G., Rupprecht, C. E. A five year (1985-1989) retrospective study of equine neurological diseases with special reference to rabies. Journal of Comparative Pathology. 106 (4), 411-421 (1992).
- Inoue, S., et al. Cross-reactive antigenicity of nucleoproteins of lyssaviruses recognized by a monospecific antirabies virus nucleoprotein antiserum on paraffin sections of formalin-fixed tissues. Pathology International. 53 (8), 525-533 (2003).
- Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
- Feiden, W., et al. Immunohistochemical staining of rabies virus antigen with monoclonal and polyclonal antibodies in paraffin tissue sections. Zentralblatt fur Veterinarmedizin Reihe B. 35 (4), 247-255 (1988).
- Manning, S. E., et al. Human rabies prevention–United States, 2008: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices. Morbidity and Mortality Weekly Reports Recommendations and Reports. 57, 1-28 (2008).
- WHO. . Laboratory techniques in rabies. 1, 67-72 (2018).
- Patrick, E. M., et al. Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test. Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).
- Whitfield, S. G., et al. A comparative study of the fluorescent antibody test for rabies diagnosis in fresh and formalin-fixed brain tissue specimens. Journal of Virology Methods. 95 (1-2), 145-151 (2001).
- WHO. . Diagnostic procedures for antigen detection. , (2016).
- Jarvis, J. A., Franke, M. A., Davis, A. D. Rabies direct fluorescent antibody test does not inactivate rabies or eastern equine encephalitis viruses. Journal of Virology Methods. 234, 52-53 (2016).
