Immunhistochemischer Test für den Lyssavirus-Antigennachweis aus formalinfixierten Geweben
Summary
Hier stellen wir ein immunhistochemisches Testprotokoll zum Nachweis von Tollwutvirus-Antigen als alternativen diagnostischen Test für formalinfixierte Gewebe vor.
Abstract
Eine der primären diagnostischen Modalitäten für Tollwut ist der Nachweis des viralen Ribonukleoprotein (RNP) -Komplexes (Antigen) in den infizierten Gewebeproben. Während der direkte fluoreszierende Antikörpertest (DFA) oder der direkte immunhistochemische Schnelltest (DRIT) am häufigsten für den Antigennachweis verwendet werden, benötigen beide Tests frisches und / oder gefrorenes Gewebe für Abdrücke auf Objektträgern vor dem Antigennachweis mit Antikörpern. Wenn Proben gesammelt und in Formalin fixiert werden, ist keiner der Tests optimal für den Antigennachweis, jedoch können Tests durch konventionelle Immunhistochemie (IHC) nach Einbettung in Paraffinblöcke und Schnitte durchgeführt werden. Bei dieser IHC-Methode werden Gewebe mit Anti-Tollwut-Antikörpern gefärbt, Abschnitte deparaffiniert, Antigene durch partielle Proteolyse oder andere Methoden entnommen und mit primären und sekundären Antikörpern inkubiert. Antigene werden mit Meerrettichperoxidase / Aminoethylcarboxazol gefärbt und mit Hämatoxylin für die Visualisierung mit einem Lichtmikroskop gegengefärbt. Neben dem spezifischen Antigennachweis bietet die Formalinfixierung weitere Vorteile wie die Bestimmung histologischer Veränderungen, entspannte Bedingungen für die Lagerung und den Transport von Proben (unter Umgebungstemperaturen), die Möglichkeit, retrospektive Fälle zu testen und die biologische Sicherheit durch die Inaktivierung von Infektionserregern zu verbessern.
Introduction
Tollwut ist eine akute progressive Enzephalitis, die durch die RNA-Viren des negativen Sinnes der Gattung Lyssavirus1verursacht wird. Fast 99% aller todesfälle beim Menschen, die durch die Infektion mit dem Tollwutvirus (RABV), dem Typmitglied der Gattung, verursacht werden, werden von Hunden übertragen2. Die Tollwutdiagnose verdächtiger Tiere beruht auf dem Nachweis von Antigen (hauptsächlich viral kodiertes Nukleoprotein, N-Protein) im Komplex mit genomischer RNA (Ribonukleoproteinkomplex, RNP) im Hirngewebe3. Der Antigennachweis durch den direkt fluoreszierenden Antikörpertest (DFA) gilt als Goldstandard für die Tollwutdiagnose4. Das Verfahren verwendet frisches oder frisches gefrorenes Hirnmaterial, einen Berührungsabdruck auf einem Objektträger, Fixierung in Aceton, Färbung mit handelsüblichen fluoreszierenden Isothiocyanat (FITC) markierten monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern (mAbs/pAbs) und wird von der Fluoreszenzmikroskopieabgelesen 5. Der DFA-Test ist schnell, empfindlich und spezifisch für den Nachweis von Tollwutantigen in frischem Hirngewebe. Vor kurzem wurde gezeigt, dass ein direkter immunhistochemischer Schnelltest (DRIT), eine modifizierte immunhistochemische (IHC) -Technik, eine ähnliche Empfindlichkeit wie DFA aufweist, aber den Vorteil der Lichtmikroskopie für die Visualisierung bietet6. Während die im DRIT verwendete Nachweismethode der IHC ähnelt, verwendet der erste Schritt frisches oder gefrorenes Gewebe, um Berührungsabdrücke der Probe zu erzeugen, gefolgt von einer Fixierung in Formalin.
IHC ist eine weit verbreitete Technik zur Bestimmung histologischer Veränderungen und zum Nachweis von Proteinen mit spezifischen Antikörpern in formalinfixierten Geweben, die in Paraffinblöcke eingebettet sind. IHC ist ein etablierter alternativer Test für den Tollwutantigennachweis in den Gewebeabschnitten7. IHC wurde insbesondere für die Diagnose von retrospektiven Fällen eingesetzt, die neurologische Erkrankungen aufwiesen, um die Belastung durch Tollwut zu bestimmen8. Paraffin-eingebettete formalinfixierte Gewebe bewahren die Proteine für den Nachweis auch nach mehreren Jahren, wenn sie bei Umgebungstemperatur9 gelagertwerden. Die Formalin-Behandlung modifiziert Proteine durch Vernetzung und Veränderung der Aminosäure-Seitenketten, wodurch die Epitope möglicherweise nicht mehr gegen Antikörper reaktiv sind10. Während der IHC-Test für den Nachweis von Tollwutantigen entweder mAbs oder pAbs umfasst, ist letzteres vorteilhaft, da mehrere Epitope und divergente Lyssaviren nachgewiesen werden können11.
Die Standardschritte bei IHC sind die Formalinfixierung von Geweben, die Einbettung in Paraffinblöcke, die Sektionierung von Geweben, die Deparaffinisierung und Hydratation, die Epitoprückgewinnung, die Reaktivität gegen primäre und sekundäre Antikörper und die Entwicklung mit chromogenen Substraten. Dieses Manuskript beschreibt einen detaillierten Bericht über das Protokoll zur Tollwutdiagnose. Für den Nachweis von Tollwutantigenen wird Mausserum, das mit RABV (pAbs) immunisiert ist, das an den US-amerikanischen Centers for Disease Control and Prevention (CDC) Atlanta, Georgia, in Kombination mit biotinylierten sekundären Anti-Maus-Antikörpern erzeugt wurde, verwendet. Biotinylierte Abs werden durch Zugabe von Streptavidin-Meerrettichperoxidase (HRP) -Komplex nachgewiesen, gefolgt von der Farbentwicklung mit Amino-Ethylcarbazol-Substrat.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aufgrund der hohen Sterblichkeitsrate der Tollwut nach Symptombeginn ist die Diagnose verdächtiger Tiere für eine RABV-Infektion äußerst kritisch für eine angemessene prophylaktische Behandlung nach der Exposition. Die Tollwutdiagnose hängt in erster Linie von DFA-, DRIT- und PCR-basierten Techniken mit frischem oder gefrorenem Gewebe ab. Für die Untersuchung von formalinfixiertem Gewebe bietet der IHC-Test eine alternative Methode zum sensitiven und spezifischen Nachweis von RABV-Antigen. Während die in Formalin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken den Arbeitern, Epidemiologen und Verbundenen der Gesundheitsbehörden für die Probeneinreichungen an die Zentren für Krankheitskontrolle und Prävention. Die Ergebnisse und Schlussfolgerungen in diesem Bericht sind die der Autoren und stellen nicht unbedingt die offizielle Position der Zentren für Krankheitskontrolle und Prävention dar. Die Verwendung von Handelsnamen und kommerziellen Quellen ist nur zur Identifizierung und impliziert keine Billigung durch die Zentren für Krankheitskontrolle und Prävention.
Materials
| 3% hydrogen peroxide | Pharamacy brands | Off the shelf 3% H2O2 | |
| 3-Amino-9-ethylcarbazole (AEC) | Millipore Sigma | A6926 | |
| Acetate Buffer pH 5.2 | Poly Scientific R&D Corp. | s140 | |
| Buffered Formalin 10% Phosphate Buffered | Fisher Scientific | SF100-4 | Certified |
| Cover slips Corning | Fisher Scientific | 12-553-471 | 24 X 50 mm |
| Ethanol 190 Proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol 200 Proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Gill's hematoxylin formulation #2 | Fisher Scientific | CS401-1D | |
| HistoMark Biotin-Streptavidin Peroxidase Kit | seracare | 71-00-18 | Mouse Primary Antibody |
| ImmunoHistoMount | Millipore Sigma | i1161 | Mounting media |
| N,N, Dimethyl formamide GR | Fisher Scientific | D119 | |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone | RR14440.01 | 01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6) |
| Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 Objective | Multiple vendors | ||
| Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Objective | Multiple vendors | ||
| Pronase | Millipore Sigma | 53702 | Protease, Streptomyces griseus |
| Scott's Tap Water | Poly Scientific R&D Corp. | s1887 | |
| Tissue-Tek Slide stain set | Fisher Scientific | 50-294-72 | |
| TWEEN-80 | Millipore Sigma | P1754 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3S-4 | Histological Grade |
| Zeiss Axioplan 2 imaging – microscope | Multiple vendors |
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