اختبار الكيمياء المناعية للكشف عن مستضد فيروس ليسا من الأنسجة الثابتة الفورمالين
Summary
هنا، نقدم بروتوكول اختبار الكيمياء المناعية للكشف عن مستضد فيروس داء الكلب كاختبار تشخيصي بديل للأنسجة الثابتة بالفورمالين.
Abstract
واحدة من الطرائق التشخيصية الأولية لداء الكلب هو الكشف عن الريبونوكليوبروتين الفيروسي (RNP) مجمع (مستضد) في عينات الأنسجة المصابة. في حين أن اختبار الأجسام المضادة الفلورية المباشرة (DFA) أو الاختبار المناعي السريع المباشر (DRIT) يستخدمان بشكل شائع للكشف عن المستضد ، فإن كلا الاختبارين يتطلبان أنسجة طازجة و / أو مجمدة للانطباعات على الشرائح قبل الكشف عن المستضد باستخدام الأجسام المضادة. إذا تم جمع العينات وإصلاحها في الفورمالين، لا يكون أي من الاختبارين الأمثل للكشف عن المستضد، ومع ذلك، يمكن إجراء الاختبار عن طريق الكيمياء المناعية التقليدية (IHC) بعد تضمينها في كتل البارافين والقسم. مع هذه الطريقة IHC ، تلطخ الأنسجة بالأجسام المضادة لداء الكلب ، ويتم إزالة الأقسام ، واسترجاع المستضد عن طريق انحلال جزئي أو طرق أخرى ، واحتضانها بأجسام مضادة أولية وثانوية. وتلطخ المستضدات باستخدام الفجل peroxidase / الأمينية إيثيل كاربازول ومضادة ملطخة hematoxylin للتصور باستخدام المجهر الخفيف. بالإضافة إلى الكشف عن مستضد محددة، تثبيت الفورمالين يقدم مزايا أخرى مثل تحديد التغيرات النسيجية، وظروف استرخاء لتخزين العينات والنقل (تحت درجات الحرارة المحيطة)، والقدرة على اختبار الحالات بأثر رجعي وتحسين السلامة البيولوجية من خلال تعطيل العوامل المعدية.
Introduction
داء الكلب هو التهاب الدماغ التدريجي الحاد الناجم عن الشعور السلبي فيروسات الحمض النووي الريبي التي تنتمي إلى جنس lyssavirus1. ما يقرب من 99٪ من جميع الوفيات البشرية الناجمة عن العدوى بفيروس داء الكلب (RABV)، وهو نوع عضو من جنس، وينتقل عن طريق ال2. داء الكلب تشخيص الحيوانات المشتبه به يعتمد على الكشف عن مستضد (في المقام الأول الفيروسية المشفرة نيوكليوبروتين, N البروتين) في مجمع مع الحمض النووي الريبي الجينومي (ريبونوكليوبروتين المعقدة, RNP) في أنسجة الدماغ3. يعتبر الكشف عن المستضد من خلال اختبار الأجسام المضادة الفلورية المباشرة (DFA) المعيار الذهبي لتشخيص داء الكلب4. تستخدم الطريقة مواد الدماغ المجمدة الطازجة أو الطازجة ، وانطباع اللمس على الشريحة ، والتثبيت في الأسيتون ، والتلطيخ باستخدام الأيزوثيوسيانات الفلورية المتاحة تجاريا (FITC) المسماة الأجسام المضادة أحادية النسيلة أو متعددة النسيلة (mAbs / pAbs) وقراءتها من قبل المجهر الفلوري5. اختبار DFA سريع وحساس ومحدد للكشف عن مستضد داء الكلب في أنسجة الدماغ الطازجة. في الآونة الأخيرة ، تم إثبات اختبار كيميائي مناعي سريع مباشر (DRIT) ، تقنية الكيمياء المناعية المعدلة (IHC) ، لإظهارحساسيةمماثلة ل DFA ولكنه يوفر ميزة المجهر الخفيف للتصور 6 . في حين أن طريقة الكشف المستخدمة في DRIT ، تشبه IHC ، فإن الخطوة الأولية تستخدم الأنسجة الطازجة أو المجمدة لتوليد انطباعات لمسة عن العينة تليها التثبيت في الفورملين.
IHC هو تقنية تستخدم على نطاق واسع لتحديد التغيرات النسيجية والكشف عن البروتينات باستخدام أجسام مضادة محددة في الأنسجة الثابتة الفورماتين جزءا لا يتجزأ من كتل البارافين. IHC هو اختبار بديل راسخ للكشف عن مستضد داء الكلب في أقسام الأنسجة7. وقد استخدمت بشكل خاص IHC لتشخيص الحالات بأثر رجعي التي أظهرت الأمراض العصبية لتحديد عبء داء الكلب8. البارافين جزءا لا يتجزأ من الأنسجة الفورملين الثابتة الحفاظ على البروتينات للكشف حتى بعد عدة سنوات عند تخزينها في درجة الحرارة المحيطة9. علاج الفورمالين يعدل البروتينات عن طريق ربط وتغيير سلاسل جانبية من الأحماض الأمينية، والتي قد تجعل epitopes لم يعد رد الفعل ضد الأجسام المضادة10. في حين أن اختبار IHC للكشف عن مستضد داء الكلب ينطوي إما على mAbs أو pAbs ، فإن هذا الأخير مفيد حيث يمكن اكتشاف العديد من الأسطح وفيروسات أليسا المتباينة11.
الخطوات القياسية التي ينطوي عليها IHC هي تثبيت الأنسجة ، وتضمينها في كتل البارافين ، وتقسيم الأنسجة ، وإزالة البارافينين والترطيب ، واستعادة الظهارة ، والتفاعل ضد الأجسام المضادة الأولية والثانوية ، والتطوير باستخدام الركائز الكروموجينية. تصف هذه المخطوطة وصفا مفصلا لبروتوكول تشخيص داء الكلب. للكشف عن مستضد داء الكلب، يتم استخدام مصل الفأر المحصن ب RABV (pAbs) المتولد في المراكز الأمريكية لمكافحة الأمراض والوقاية منها (CDC) أتلانتا، جورجيا، بالاشتراك مع الأجسام المضادة الثانوية المضادة للفأرة ذات المستويات الحيوية. يتم الكشف عن القيمة المطلقة البيوتينية بإضافة مركب البيروكسيديز (HRP) من البكتيريا العقدية الفجلية (HRP) تليها تطور اللون مع ركيزة أمينية إيثيلكاربازول.
Protocol
Representative Results
Discussion
نظرا لارتفاع معدل الوفيات الناجمة عن داء الكلب بعد ظهور الأعراض ، فإن تشخيص الحيوانات المشتبه بها لعدوى RABV أمر بالغ الأهمية لعلاج وقائي مناسب بعد التعرض. يعتمد تشخيص داء الكلب في المقام الأول على تقنيات DFA و DRIT و PCR باستخدام الأنسجة الطازجة أو المجمدة. لاختبار الأنسجة المثبتة بالفورمولين، …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر أخصائيي المختبرات وأخصائيي الأوبئة والشركات التابعة لإدارات الصحة العامة على تقديم عينات إلى مراكز مكافحة الأمراض والوقاية منها. النتائج والاستنتاجات الواردة في هذا التقرير هي النتائج والاستنتاجات التي توصل إليها المؤلفون ولا تمثل بالضرورة الموقف الرسمي لمراكز مكافحة الأمراض والوقاية منها. استخدام الأسماء التجارية والمصادر التجارية هي لتحديد الهوية فقط ولا يعني موافقة من قبل مراكز مكافحة الأمراض والوقاية منها.
Materials
| 3% hydrogen peroxide | Pharamacy brands | Off the shelf 3% H2O2 | |
| 3-Amino-9-ethylcarbazole (AEC) | Millipore Sigma | A6926 | |
| Acetate Buffer pH 5.2 | Poly Scientific R&D Corp. | s140 | |
| Buffered Formalin 10% Phosphate Buffered | Fisher Scientific | SF100-4 | Certified |
| Cover slips Corning | Fisher Scientific | 12-553-471 | 24 X 50 mm |
| Ethanol 190 Proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol 200 Proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Gill's hematoxylin formulation #2 | Fisher Scientific | CS401-1D | |
| HistoMark Biotin-Streptavidin Peroxidase Kit | seracare | 71-00-18 | Mouse Primary Antibody |
| ImmunoHistoMount | Millipore Sigma | i1161 | Mounting media |
| N,N, Dimethyl formamide GR | Fisher Scientific | D119 | |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone | RR14440.01 | 01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6) |
| Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 Objective | Multiple vendors | ||
| Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Objective | Multiple vendors | ||
| Pronase | Millipore Sigma | 53702 | Protease, Streptomyces griseus |
| Scott's Tap Water | Poly Scientific R&D Corp. | s1887 | |
| Tissue-Tek Slide stain set | Fisher Scientific | 50-294-72 | |
| TWEEN-80 | Millipore Sigma | P1754 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3S-4 | Histological Grade |
| Zeiss Axioplan 2 imaging – microscope | Multiple vendors |
References
- Rupprecht, C., Kuzmin, I., Meslin, F. Lyssaviruses and rabies: current conundrums, concerns, contradictions and controversies. F1000Research. 6, 184 (2017).
- Fooks, A. R., et al. Current status of rabies and prospects for elimination. Lancet. 384 (9951), 1389-1399 (2014).
- Finke, S., Brzozka, K., Conzelmann, K. K. Tracking fluorescence-labeled rabies virus: enhanced green fluorescent protein-tagged phosphoprotein P supports virus gene expression and formation of infectious particles. Journal of Virology. 78 (22), 12333-12343 (2004).
- WHO. WHO Expert Consulation on Rabies, Third Report. WHO Technical Report Series. 1012, 1 (2018).
- Goldwasser, R. A., Kissling, R. E. Fluorescent antibody staining of street and fixed rabies virus antigens. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 98 (2), 219-223 (1958).
- Lembo, T., et al. Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis. Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).
- Fekadu, M., Greer, P. W., Chandler, F. W., Sanderlin, D. W. Use of the avidin-biotin peroxidase system to detect rabies antigen in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Journal of Virological Methods. 19 (2), 91-96 (1988).
- Hamir, A. N., Moser, G., Rupprecht, C. E. A five year (1985-1989) retrospective study of equine neurological diseases with special reference to rabies. Journal of Comparative Pathology. 106 (4), 411-421 (1992).
- Inoue, S., et al. Cross-reactive antigenicity of nucleoproteins of lyssaviruses recognized by a monospecific antirabies virus nucleoprotein antiserum on paraffin sections of formalin-fixed tissues. Pathology International. 53 (8), 525-533 (2003).
- Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
- Feiden, W., et al. Immunohistochemical staining of rabies virus antigen with monoclonal and polyclonal antibodies in paraffin tissue sections. Zentralblatt fur Veterinarmedizin Reihe B. 35 (4), 247-255 (1988).
- Manning, S. E., et al. Human rabies prevention–United States, 2008: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices. Morbidity and Mortality Weekly Reports Recommendations and Reports. 57, 1-28 (2008).
- WHO. . Laboratory techniques in rabies. 1, 67-72 (2018).
- Patrick, E. M., et al. Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test. Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).
- Whitfield, S. G., et al. A comparative study of the fluorescent antibody test for rabies diagnosis in fresh and formalin-fixed brain tissue specimens. Journal of Virology Methods. 95 (1-2), 145-151 (2001).
- WHO. . Diagnostic procedures for antigen detection. , (2016).
- Jarvis, J. A., Franke, M. A., Davis, A. D. Rabies direct fluorescent antibody test does not inactivate rabies or eastern equine encephalitis viruses. Journal of Virology Methods. 234, 52-53 (2016).
