Summary

Immunhistochemischer Test für den Lyssavirus-Antigennachweis aus formalinfixierten Geweben

Published: October 26, 2021
doi:

Summary

Hier stellen wir ein immunhistochemisches Testprotokoll zum Nachweis von Tollwutvirus-Antigen als alternativen diagnostischen Test für formalinfixierte Gewebe vor.

Abstract

Eine der primären diagnostischen Modalitäten für Tollwut ist der Nachweis des viralen Ribonukleoprotein (RNP) -Komplexes (Antigen) in den infizierten Gewebeproben. Während der direkte fluoreszierende Antikörpertest (DFA) oder der direkte immunhistochemische Schnelltest (DRIT) am häufigsten für den Antigennachweis verwendet werden, benötigen beide Tests frisches und / oder gefrorenes Gewebe für Abdrücke auf Objektträgern vor dem Antigennachweis mit Antikörpern. Wenn Proben gesammelt und in Formalin fixiert werden, ist keiner der Tests optimal für den Antigennachweis, jedoch können Tests durch konventionelle Immunhistochemie (IHC) nach Einbettung in Paraffinblöcke und Schnitte durchgeführt werden. Bei dieser IHC-Methode werden Gewebe mit Anti-Tollwut-Antikörpern gefärbt, Abschnitte deparaffiniert, Antigene durch partielle Proteolyse oder andere Methoden entnommen und mit primären und sekundären Antikörpern inkubiert. Antigene werden mit Meerrettichperoxidase / Aminoethylcarboxazol gefärbt und mit Hämatoxylin für die Visualisierung mit einem Lichtmikroskop gegengefärbt. Neben dem spezifischen Antigennachweis bietet die Formalinfixierung weitere Vorteile wie die Bestimmung histologischer Veränderungen, entspannte Bedingungen für die Lagerung und den Transport von Proben (unter Umgebungstemperaturen), die Möglichkeit, retrospektive Fälle zu testen und die biologische Sicherheit durch die Inaktivierung von Infektionserregern zu verbessern.

Introduction

Tollwut ist eine akute progressive Enzephalitis, die durch die RNA-Viren des negativen Sinnes der Gattung Lyssavirus1verursacht wird. Fast 99% aller todesfälle beim Menschen, die durch die Infektion mit dem Tollwutvirus (RABV), dem Typmitglied der Gattung, verursacht werden, werden von Hunden übertragen2. Die Tollwutdiagnose verdächtiger Tiere beruht auf dem Nachweis von Antigen (hauptsächlich viral kodiertes Nukleoprotein, N-Protein) im Komplex mit genomischer RNA (Ribonukleoproteinkomplex, RNP) im Hirngewebe3. Der Antigennachweis durch den direkt fluoreszierenden Antikörpertest (DFA) gilt als Goldstandard für die Tollwutdiagnose4. Das Verfahren verwendet frisches oder frisches gefrorenes Hirnmaterial, einen Berührungsabdruck auf einem Objektträger, Fixierung in Aceton, Färbung mit handelsüblichen fluoreszierenden Isothiocyanat (FITC) markierten monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern (mAbs/pAbs) und wird von der Fluoreszenzmikroskopieabgelesen 5. Der DFA-Test ist schnell, empfindlich und spezifisch für den Nachweis von Tollwutantigen in frischem Hirngewebe. Vor kurzem wurde gezeigt, dass ein direkter immunhistochemischer Schnelltest (DRIT), eine modifizierte immunhistochemische (IHC) -Technik, eine ähnliche Empfindlichkeit wie DFA aufweist, aber den Vorteil der Lichtmikroskopie für die Visualisierung bietet6. Während die im DRIT verwendete Nachweismethode der IHC ähnelt, verwendet der erste Schritt frisches oder gefrorenes Gewebe, um Berührungsabdrücke der Probe zu erzeugen, gefolgt von einer Fixierung in Formalin.

IHC ist eine weit verbreitete Technik zur Bestimmung histologischer Veränderungen und zum Nachweis von Proteinen mit spezifischen Antikörpern in formalinfixierten Geweben, die in Paraffinblöcke eingebettet sind. IHC ist ein etablierter alternativer Test für den Tollwutantigennachweis in den Gewebeabschnitten7. IHC wurde insbesondere für die Diagnose von retrospektiven Fällen eingesetzt, die neurologische Erkrankungen aufwiesen, um die Belastung durch Tollwut zu bestimmen8. Paraffin-eingebettete formalinfixierte Gewebe bewahren die Proteine für den Nachweis auch nach mehreren Jahren, wenn sie bei Umgebungstemperatur9 gelagertwerden. Die Formalin-Behandlung modifiziert Proteine durch Vernetzung und Veränderung der Aminosäure-Seitenketten, wodurch die Epitope möglicherweise nicht mehr gegen Antikörper reaktiv sind10. Während der IHC-Test für den Nachweis von Tollwutantigen entweder mAbs oder pAbs umfasst, ist letzteres vorteilhaft, da mehrere Epitope und divergente Lyssaviren nachgewiesen werden können11.

Die Standardschritte bei IHC sind die Formalinfixierung von Geweben, die Einbettung in Paraffinblöcke, die Sektionierung von Geweben, die Deparaffinisierung und Hydratation, die Epitoprückgewinnung, die Reaktivität gegen primäre und sekundäre Antikörper und die Entwicklung mit chromogenen Substraten. Dieses Manuskript beschreibt einen detaillierten Bericht über das Protokoll zur Tollwutdiagnose. Für den Nachweis von Tollwutantigenen wird Mausserum, das mit RABV (pAbs) immunisiert ist, das an den US-amerikanischen Centers for Disease Control and Prevention (CDC) Atlanta, Georgia, in Kombination mit biotinylierten sekundären Anti-Maus-Antikörpern erzeugt wurde, verwendet. Biotinylierte Abs werden durch Zugabe von Streptavidin-Meerrettichperoxidase (HRP) -Komplex nachgewiesen, gefolgt von der Farbentwicklung mit Amino-Ethylcarbazol-Substrat.

Protocol

Während das IHC-Protokoll an formalinfixierten Geweben durchgeführt wurde, die RABV inaktivieren, falls vorhanden, sollten geeignete Biosicherheitsprotokolle ordnungsgemäß befolgt werden. Alle Biosicherheitsverfahren sind in der Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) 5th Edition (https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm) beschrieben, einschließlich des Tragens geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA) und der Impfpflicht wie beschrieben12. Dar…

Representative Results

Abbildung 2 zeigt repräsentative IHC-Färbeergebnisse von Positiv- und Negativkontrollproben in verschiedenen getesteten Hirngeweben. Abbildung 2A,D,G stellen positive Proben mit 200x dar, während Abbildung 2B,E,H jeweils einer 400-fachen Vergrößerung entsprechen. Abbildung 2A-C entsprechen dem Hirnstamm; <strong cla…

Discussion

Aufgrund der hohen Sterblichkeitsrate der Tollwut nach Symptombeginn ist die Diagnose verdächtiger Tiere für eine RABV-Infektion äußerst kritisch für eine angemessene prophylaktische Behandlung nach der Exposition. Die Tollwutdiagnose hängt in erster Linie von DFA-, DRIT- und PCR-basierten Techniken mit frischem oder gefrorenem Gewebe ab. Für die Untersuchung von formalinfixiertem Gewebe bietet der IHC-Test eine alternative Methode zum sensitiven und spezifischen Nachweis von RABV-Antigen. Während die in Formalin…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken den Arbeitern, Epidemiologen und Verbundenen der Gesundheitsbehörden für die Probeneinreichungen an die Zentren für Krankheitskontrolle und Prävention. Die Ergebnisse und Schlussfolgerungen in diesem Bericht sind die der Autoren und stellen nicht unbedingt die offizielle Position der Zentren für Krankheitskontrolle und Prävention dar. Die Verwendung von Handelsnamen und kommerziellen Quellen ist nur zur Identifizierung und impliziert keine Billigung durch die Zentren für Krankheitskontrolle und Prävention.

Materials

3% hydrogen peroxide Pharamacy brands Off the shelf 3% H2O2
3-Amino-9-ethylcarbazole (AEC) Millipore Sigma A6926
Acetate Buffer pH 5.2 Poly Scientific R&D Corp. s140
Buffered Formalin 10% Phosphate Buffered Fisher Scientific SF100-4 Certified
Cover slips Corning Fisher Scientific 12-553-471 24 X 50 mm
Ethanol 190 Proof Pharmco-AAPER 111000190
Ethanol 200 Proof Pharmco-AAPER 111000200
Gill's hematoxylin formulation #2 Fisher Scientific CS401-1D
HistoMark Biotin-Streptavidin Peroxidase Kit seracare 71-00-18 Mouse Primary Antibody 
ImmunoHistoMount Millipore Sigma i1161 Mounting media
N,N, Dimethyl formamide GR Fisher Scientific D119
Phosphate Buffered Saline  HyClone RR14440.01 01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6)
Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 Objective Multiple vendors
Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Objective Multiple vendors
Pronase Millipore Sigma 53702 Protease, Streptomyces griseus
Scott's Tap Water  Poly Scientific R&D Corp. s1887
Tissue-Tek Slide stain set Fisher Scientific 50-294-72
TWEEN-80  Millipore Sigma P1754
Xylene Fisher Scientific X3S-4 Histological Grade
Zeiss Axioplan 2 imaging – microscope Multiple vendors

References

  1. Rupprecht, C., Kuzmin, I., Meslin, F. Lyssaviruses and rabies: current conundrums, concerns, contradictions and controversies. F1000Research. 6, 184 (2017).
  2. Fooks, A. R., et al. Current status of rabies and prospects for elimination. Lancet. 384 (9951), 1389-1399 (2014).
  3. Finke, S., Brzozka, K., Conzelmann, K. K. Tracking fluorescence-labeled rabies virus: enhanced green fluorescent protein-tagged phosphoprotein P supports virus gene expression and formation of infectious particles. Journal of Virology. 78 (22), 12333-12343 (2004).
  4. WHO. WHO Expert Consulation on Rabies, Third Report. WHO Technical Report Series. 1012, 1 (2018).
  5. Goldwasser, R. A., Kissling, R. E. Fluorescent antibody staining of street and fixed rabies virus antigens. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 98 (2), 219-223 (1958).
  6. Lembo, T., et al. Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis. Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).
  7. Fekadu, M., Greer, P. W., Chandler, F. W., Sanderlin, D. W. Use of the avidin-biotin peroxidase system to detect rabies antigen in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Journal of Virological Methods. 19 (2), 91-96 (1988).
  8. Hamir, A. N., Moser, G., Rupprecht, C. E. A five year (1985-1989) retrospective study of equine neurological diseases with special reference to rabies. Journal of Comparative Pathology. 106 (4), 411-421 (1992).
  9. Inoue, S., et al. Cross-reactive antigenicity of nucleoproteins of lyssaviruses recognized by a monospecific antirabies virus nucleoprotein antiserum on paraffin sections of formalin-fixed tissues. Pathology International. 53 (8), 525-533 (2003).
  10. Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
  11. Feiden, W., et al. Immunohistochemical staining of rabies virus antigen with monoclonal and polyclonal antibodies in paraffin tissue sections. Zentralblatt fur Veterinarmedizin Reihe B. 35 (4), 247-255 (1988).
  12. Manning, S. E., et al. Human rabies prevention–United States, 2008: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices. Morbidity and Mortality Weekly Reports Recommendations and Reports. 57, 1-28 (2008).
  13. WHO. . Laboratory techniques in rabies. 1, 67-72 (2018).
  14. Patrick, E. M., et al. Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test. Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).
  15. Whitfield, S. G., et al. A comparative study of the fluorescent antibody test for rabies diagnosis in fresh and formalin-fixed brain tissue specimens. Journal of Virology Methods. 95 (1-2), 145-151 (2001).
  16. WHO. . Diagnostic procedures for antigen detection. , (2016).
  17. Jarvis, J. A., Franke, M. A., Davis, A. D. Rabies direct fluorescent antibody test does not inactivate rabies or eastern equine encephalitis viruses. Journal of Virology Methods. 234, 52-53 (2016).

Play Video

Cite This Article
Niezgoda, M., Subbian Satheshkumar, P. Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues. J. Vis. Exp. (176), e60138, doi:10.3791/60138 (2021).

View Video