Summary

Memeli Hücrelerinin Bakteri Mücadelesinden Sonra Stres Granül Oluşumunun İmmünofloresan Analizi

Published: July 03, 2017
doi:

Summary

Hücrelere bakterilerle ve birkaç farklı stresle meydan okuduktan sonra, memeli hücrelerinde stres granülü oluşumunun nitel ve nicel analizi için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol, konakçı-bakteriyel etkileşimlerin geniş bir aralığında hücresel stres granül tepkisini araştırmak için uygulanabilir.

Abstract

Hücresel bileşenlerin floresan görüntülemesi konakçı-patojen etkileşimlerini araştırmak için etkili bir araçtır. Patojenler, organelle ultrastrüktür, hücre iskeleti ağ organizasyonu ve ayrıca Stres Granülü (SG) oluşumu gibi hücresel işlemleri de içeren enfekte hücrelerin birçok farklı özelliğini etkileyebilir. Patojenlerin konakçı süreçleri nasıl alt üst ettirdiklerinin karakterizasyonu patojenez alanının önemli ve ayrılmaz bir parçasıdır. Değişken fenotipler kolayca görülebiliyor olsa da, patojen yüklemesiyle indüklenen hücresel yapıların nitel ve niceliksel farklılıklarının kesin analizi, deneysel ve kontrol örnekleri arasındaki istatistiksel olarak önemli farklılıkların tanımlanması için gereklidir. SG oluşumu, antiviral yanıtlara yol açan evrimsel olarak korunmuş bir stres tepkisidir ve uzun süredir viral enfeksiyonlar 1 kullanarak araştırılmıştır. SG oluşumu aynı zamanda sinyal kaskatlarını da etkiler ve hala bilinmeyen diğer kavramlara sahip olabilir2 . Bakteriyel patojenler gibi virüs dışındaki patojenlere karşı bu stres tepkisinin karakterizasyonu şu anda ortaya çıkan bir araştırma alanıdır 3 . Şimdilik, SG oluşumunun nicel ve nitel analizi henüz viral sistemlerde rutin olarak kullanılmamaktadır. Burada, çeşitli dışsal streslere yanıt olarak SG oluşumunu etkileyen enfekte olmayan hücrelerde ve bir sitozolik bakteriyel patojen bulaşmış hücrelerde SG oluşumunu indüklemek ve karakterize etmek için basit bir yöntem tarif ediyoruz. SG oluşumunun ve bileşiminin analizi, bir dizi farklı SG işaretleyicisi ve ICY'nin açık kaynak görüntü analiz aracı olan spot detektör eklentisi kullanılarak gerçekleştirilir.

Introduction

Konukçu patojen etkileşimlerini hücre seviyesinde görselleştirmek, patojenik stratejiler hakkında fikir edinmek ve anahtar hücresel yolları tanımlamak için güçlü bir yöntemdir. Gerçekten, patojenler önemli hücresel hedefleri veya yapıları saptamak için araçlar olarak kullanılabilirler, çünkü patojenler merkezi hücresel prosesleri kendi hayatta kalmaları veya yayılımı için bir strateji olarak yıkmaya dönüşmüştür. Hücresel bileşenlerin görselleştirilmesi, flüoresanla etiketlenmiş konukçu proteinleri rekombinant şekilde eksprese ederek gerçekleştirilebilir. Bu, gerçek zamanlı analiz yapmayı sağlarken, spesifik olarak etiketlenmiş konukçu proteinler ile hücre hatlarının üretilmesi oldukça zahmetlidir ve istenmeyen yan etkilere neden olabilir. Çoklu konukçu faktörlerin aynı anda analiz edilebileceği ve birinin belirli bir hücre tipi ile sınırlı olmadığından spesifik antikorları kullanan hücresel faktörlerin saptanması daha elverişlidir. Bir dezavantaj, immünofloresans analizi, konukçu hücre fiksatını gerekli kıldığı için yalnızca statik bir görünümü yakalayabilmesidiriyon. Bununla birlikte, immünofloresan görüntülemenin önemli bir avantajı, hem niteliksel hem de niceliksel analiz için kendini kolayca bulabilmesidir. Bu, konak-patojen etkileşimlerine yeni kavrayışlar sağlamak için istatistiksel olarak önemli farklılıklar elde etmek için kullanılabilir.

Floresan görüntü analiz programları 3D ve 4D analizini gerçekleştirmek için güçlü analitik araçlardır. Bununla birlikte, yüksek maliyetli yazılım ve bakımı, açık kaynaklı yazılımlara dayalı yöntemleri daha cazip kılmaktadır. Biyolojik analiz yazılımını kullanarak dikkatli bir görüntü analizi, görsel analizi desteklediği ve istatistiksel önemleri belirlerken belirli bir fenotipin doğruluğuna olan güvenini arttırdığı için değerlidir. Daha önce SG'ler, bağımsız SG'lerin elle tanımlanmasını gerektiren ücretsiz ImageJ yazılımı kullanılarak analiz edilmiştir4. Burada, hücresel SG oluşumunun indüksiyonu ve analizi için bir protokol sağlıyoruz(ICO) (http://icy.bioimageanalysis.org) kullanılarak biyolojik enfeksiyonlara karşı korunma sağlar. Biyo-görüntü analiz yazılımı, SG analizi için oldukça uygun olan yerleşik bir spot detektör programına sahiptir. Belirli Bölgelerdeki (ROI'lar) otomatik algılama işleminin hassas ayarlanmasına izin verir. Bu, bireysel SG'lerin manuel analiz ihtiyacını ortadan kaldırır ve örnekleme yanlılığını kaldırır.

Birçok çevresel stres, 0,5 – 5 μm çapında 5 , 6 faz yoğun sitosolik, membranöz olmayan yapılar olan SG oluşumuna neden olur. Bu hücresel tepki, maya, bitkiler ve memelilerde evrimsel olarak korunur ve genel protein translasyonu engellendiğinde oluşur. Translatedly-inactive mRNA'lar için tutulan yerler olarak kabul edilen, hücresel mRNA'ların bir alt grubunun seçici çevirisine izin veren SG'ye durdurulmuş çeviri başlatma komplekslerinin toplanmasını içerir.Stresin giderilmesiyle, SG'ler eritilir ve küresel protein sentezi oranları devam eder. SG'ler, uygulanan strese bağlı olarak tam kompozisyonun değişmesine rağmen, translasyon uzama başlatma faktörleri, RNA metabolizmasına katılan proteinler, RNA-bağlayıcı proteinlerin yanı sıra iskele proteinleri ve konakçı hücre sinyallemesi 2'ye dahil olan faktörlerden oluşur. SG oluşumunu uyaran çevresel faktörler, amino asit açlığı, UV ışınlaması, ısı şoku, ozmotik şok, endoplazmik retikulum stres, hipoksi ve viral enfeksiyonu içerir 2 , 7 , 8 . Bakteriyel, mantar veya protozoon patojenler gibi diğer patojenlerin bu hücresel stres tepkisini nasıl etkilediği hakkında henüz çok az şey bilinmesine rağmen, virüslerin SG oluşumunu nasıl indüklediğini ve yok ettiğini anlamada çok ilerleme kaydedildi 1 , 7 .

ShigeLla flexneri, insanlarda gram negatif fakültatif bir sitozolik patojendir ve şiddetli ishal ya da shigellosis'in sebep olduğu ajandır. Shigellosis önemli bir halk sağlığı yüküdür ve 9 , 10 yaşlarındaki 5 yaşın altındaki çocuklarda yılda 28.000 ölüme neden olur. S. flexneri , kolonik epiteli enfekte eder ve konak hücrenin hücre iskelet sistemi bileşenlerini 11 , 12'yi kaçırarak hücre-hücreye yayılır. Epitelin enfeksiyonu S. flexneri'nin sitoplazmada çoğalmasını destekler, ancak enfekte makrofajlar pyroptoz adı verilen inflamatuar bir hücre ölümü süreciyle ölürler. Enfeksiyon, nötrofillerin büyük miktarda alınmasına ve ısı, oksidatif stres ve doku tahribatının eşlik ettiği ciddi inflamasyona neden olur. Böylece, enfekte olmuş hücreler, Golgi bozulması, genotoksik stres ve sitoskeletal yeniden düzenlenme gibi, enfeksiyon tarafından indüklenen iç strese maruz kalırlar.S, enfekte hücreler de inflamasyon süreci nedeniyle çevresel strese maruz kalmaktadır.

S. flexneri enfeksiyonunun, hücrelerin bir takım SG markörleri kullanarak çevresel streslere tepki verme kabiliyeti üzerindeki etkisinin karakterizasyonu, enfeksiyonun SG bileşimi 3'teki kalitatif ve kantitatif farklılıklara yol açtığını ortaya koymuştur. Bununla birlikte, diğer bakteriyel patojenler hakkında çok az şey bilinmektedir. Burada, konakçı hücrelerin sitosolik patojen S. flexneri ile infeksiyonu için bir metodoloji, farklı çevresel streslere sahip hücrelerin streslenmesi , SG bileşenlerinin etiketlenmesi ve enfekte bağlamında SG oluşumunun ve kompozisyonunun nitel ve nicel analizleri anlatılmaktadır. Ve enfekte olmayan hücreler. Bu yöntem, diğer bakteriyel patojenler için yaygın olarak uygulanabilir. Buna ek olarak, SG oluşumunun görüntü analizi virüsler veya diğer patojenlerin neden olduğu enfeksiyonlar için kullanılabilir. SG'yi analiz etmek için kullanılabilirEnfeksiyona bağlı oluşum veya enfeksiyonun dış kaynaklı streslere yanıt olarak SG oluşumu üzerindeki etkisi.

Protocol

1. Bakteri ve konakçı hücrelerin hazırlanması Deneysel durum başına bir kere sayılan steril cımbızla sırasıyla 24 veya 12 oyuklu plakalara 12 veya 14 mm cam kapak kaydırın. Bunları bir doku kültürü kapağında UV muamelesi ile 15 dakika sterilize edin. NOT: Bakteri yüklemesi ve dış kaynaklı streslerle SG indüksiyonu için kontrol kuyularını ekleyin. 12 mm lamelleri olan 24 delikli bir plaka için, lamellerin üzerine 1 x 10 5 memeli hücresi tohumlayın ( <…

Representative Results

Bu yazıda açıklanan protokolü açıklamak ve göstermek için, cytosolik patojen S. flexneri ile enfekte olmuş veya olmayan HeLa hücrelerindeki klotrimazol kaynaklı SG'lerin görüntüsünü karakterize ettik. Prosedürün ana hatları Şekil 1'de sunulmakta ve Kongo Kırmızı plakaları üzerinde çizgili olan virulent ve avirulent S. flexneri , bakteri hazırlama, enfeksiyon, çevresel stres eklenmesi, numune fiksasyonu ve…

Discussion

Burada özetlenen protokol, dış kaynaklı stres varlığında veya yokluğunda, sitoplazmik patojen S. flexneri ile infekte olmayan hücrelerdeki ve hücrelerdeki SG'lerin indüksiyonu, lokalizasyonu ve analizini anlatmaktadır. Protokoller, serbest görüntüleme yazılımını kullanarak belirli fenotiplerde farklılıkları tanımlamak ve istatistiksel olarak ele almak için SG oluşumunun kesin kalitatif ve kantitatif analizine olanak tanır.

Enfeksiyon, SG indüksiyon ve …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

PS, Bill ve Melinda Gates Büyük Zorluk Hibe OPP1141322'yi alıyor. PV, İsviçreli Ulusal Bilim Vakfı Early Postdoc Hareketlilik bursu ve Roux-Cantarini doktora sonrası bir burs tarafından desteklendi. PJS, bir HHMI hibesi ve ERC-2013-ADG 339579-Şifre Decrypt tarafından desteklenmektedir.

Materials

Primary Antibodies
eIF3b (N20), origin goat Santa Cruz sc-16377 Robust and widely used SG marker. Cytosolic staining allows cell delineation. Dilution 1 in 300
eIF3b (A20), origin goat Santa Cruz sc-16378 Same target as eIF3b (N20) and in our hands was identical to eIF3b (N20). Dilution 1 in 300
eIF3A (D51F4), origin rabbit (MC: monoclonal) Cell Signaling 3411 Part of multiprotein eIF3 complex with eIF3b . Dilution 1 in 800
eIF4AI, origin goat Santa Cruz sc-14211 Recommended by (Ref # 13). Dilution 1 in 200
eIF4B, origin rabbit Abcam ab186856 Good stress granule marker in our hands. Dilution 1 in 300
eIF4B, origin rabbit Cell Signaling 3592 Recommended by Ref # 13. Dilution 1 in 100
eIF4G, origin rabbit Santa Cruz sc-11373 Widely used SG marker. (Ref # 13): may not work well in mouse cell lines. Dilution 1 in 300
G3BP1, origin rabbit (MC: monoclonal) BD Biosciences 611126 Widely used SG marker. Dilution 1 in 300
Tia-1, origin goat Santa Cruz sc-1751 Widely used SG marker. Can also be found in P bodies when SG are present (Ref # 13). Dilution 1 in 300
Alexa-conjugated Secondary Antibodies
A488 anti-goat , origin donkey Thermo Fisher A-11055 Cross absorbed. Dilution 1 in 500
A568 anti-goat, origin donkey Thermo Fisher A-11057 Cross absorbed. Dilution 1 in 500
A488 anti-mouse, origin donkey Thermo Fisher A-21202 Dilution 1 in 500
A568 anti-mouse, origin donkey Thermo Fisher A10037 Dilution 1 in 500
A647 anti-mouse, origin donkey Thermo Fisher A31571 Dilution 1 in 500
A488 anti-rabbit, origin donkey Thermo Fisher A-21206 Dilution 1 in 500
A568 anti-rabbit, origin donkey Thermo Fisher A10042 Dilution 1 in 500
Other Reagents
Shigella flexneri Available from various laboratories by request
Tryptone Casein Soya (TCS) broth BD Biosciences 211825 Standard growth medium for Shigella, application – bacterial growth
TCS agar BD Biosciences 236950 Standard growth agar for Shigella, application – bacterial growth
Congo red SERVA Electrophoresis GmbH 27215.01 Distrimination tool for Shigell that have lost the virulence plasmid, application – bacterial growth
Poly L lysine Sigma-Aldrich P1274 Useful to coating bacteria to increase infection, application – infection
Gentamicin Sigma-Aldrich G1397 Selective killing of extracellular but not cytosolic bacteria, application – infection
HEPES Life Technologies 15630-056 PH buffer useful when cells are incubated at room-temperature, application – cell culture
DMEM Life Technologies 31885 Standard culture medium for HeLa cells, application – cell culture
Fetal calf serum Biowest S1810-100 5% supplementation used for HeLa cell culture medium, application – cell culture
Non-essential amino acids Life Technologies 11140 1/100 dilution used for HeLa cell culture medium, application – cell culture
DMSO Sigma-Aldrich D2650 Reagent diluent, application – cell culture
Sodium arsenite Sigma-Aldrich S7400 Potent stress granule inducer (Note: highly toxic, special handling and disposal required), application – stress inducer
Clotrimazole Sigma-Aldrich C6019 Potent stress granule inducer (Note:health hazard, special handling and disposal required), application – stress inducer
PFA Electron Microscopy Scences 15714 4% PFA is used for standard fixation of cells, application – fixation
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 Used at 0.03% for permeabilizationof host cells before immunofluorescent staining, application – permeabilization
A647-phalloidin Thermo Fisher A22287 Dilution is at 1/40, best added during 2ary antibody staining, application – staining
DAPI Sigma-Aldrich D9542 Nucleid acid stain used to visualize both the host nucleus and bacteria, application – staining
Parafilm Sigma-Aldrich BR701501 Paraffin film useful for immunofluorescent staining of coverslips, application – staining
Prolong Gold Thermo Fisher 36930 Robust mounting medium that works well for most fluorophores , application – mounting
Mowiol Sigma-Aldrich 81381 Cheap and robust mounting medium that works well for most fluorophores, application – mounting
24-well cell culture plate Sigma-Aldrich CLS3527 Standard tissue culture plates, application – cell culture
12-mm glass coverslips NeuVitro 1001/12 Cell culture support for immunofluorescent applications, application – cell support
forceps Sigma-Aldrich 81381 Cheap and obust mounting medium that works well for most fluorophores, application – mounting
Programs and Equipment
Prism GraphPad Software Data analysisand graphing program with robust statistical test options, application – data analysis
Leica SP5 Leica Microsystems Confocal microsope, application – image acquisition
Imaris Bitplane Professional image analysis program, application – data analysis
Excel Microsoft Data analysis and graphing program, application – data analysis

References

  1. Reineke, L. C., Lloyd, R. E. Diversion of stress granules and P-bodies during viral infection. Virology. 436 (2), 255-267 (2013).
  2. Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase. Trends Biochem Sci. 38 (10), 494-506 (2013).
  3. Vonaesch, P., Campbell-Valois, F. -. X., Dufour, A., Sansonetti, P. J., Schnupf, P. Shigella flexneri modulates stress granule composition and inhibits stress granule aggregation. Cell Microbiol. 18 (7), 982-997 (2016).
  4. Kolobova, E., Efimov, A., et al. Microtubule-dependent association of AKAP350A and CCAR1 with RNA stress granules. Exp Cell Res. 315 (3), 542-555 (2009).
  5. Anderson, P., Kedersha, N. Stress granules: the Tao of RNA triage. Trends in biochemical sciences. 33 (3), 141-150 (2008).
  6. Anderson, P., Kedersha, N. Stressful initiations. J Cell Sci. 115, 3227-3234 (2002).
  7. Mohr, I., Sonenberg, N. Host translation at the nexus of infection and immunity. Cell Host Microbe. 12 (4), 470-483 (2012).
  8. Hu, S., Claud, E. C., Musch, M. W., Chang, E. B. Stress granule formation mediates the inhibition of colonic Hsp70 translation by interferon- and tumor necrosis factor. Am J Physiol Gastointest Liver Physiol. 298 (4), 481-492 (2010).
  9. Barry, E. M., Pasetti, M. F., Sztein, M. B., Fasano, A., Kotloff, K. L., Levine, M. M. Progress and pitfalls in Shigella vaccine research. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (4), 245-255 (2013).
  10. Lanata, C. F., Fischer-Walker, C. L., et al. Global Causes of Diarrheal Disease Mortality in Children. PloS One. 8 (9), 72788 (2013).
  11. Ashida, H., Ogawa, M., et al. Shigella deploy multiple countermeasures against host innate immune responses. Curr Opin Microbiol. 14 (1), 16-23 (2011).
  12. Ashida, H., Ogawa, M., Mimuro, H., Kobayashi, T., Sanada, T., Sasakawa, C. Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system. Curr Opin Immunol. 23 (4), 448-455 (2011).
  13. Kedersha, N., Anderson, P. Mammalian stress granules and processing bodies. Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).
  14. Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria. Nat Re. Micro. 7 (5), 333-340 (2009).

Play Video

Cite This Article
Vonaesch, P., Sansonetti, P. J., Schnupf, P. Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (125), e55536, doi:10.3791/55536 (2017).

View Video