Summary

ניתוח Immunofluorescence של גרגר מתח גיבוש לאחר האתגר בקטריאלי של תאים יונקים

Published: July 03, 2017
doi:

Summary

אנו מתארים שיטה לניתוח כמותי וכמותי של גרגר גרגר הלחץ בתאי יונקים לאחר התאים מאותגרים עם חיידקים ומספר לחצים שונים. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על מנת לחקור את התגובה גרגר הלחץ הסלולר במגוון רחב של אינטראקציות מארח חיידקי.

Abstract

הדמיה פלואורסצנטית של רכיבים סלולריים היא כלי יעיל לחקור אינטראקציות מארח פתוגן. פתוגנים יכולים להשפיע על מאפיינים שונים של תאים נגועים, כולל אולטרה אולטרה, ארגון רשת cytoskeletal, כמו גם תהליכים סלולריים כגון גרגר מתח (SG) היווצרות. האפיון של כמה פתוגנים לחתר תהליכים מארח הוא חלק חשוב ואינטגרלי של השדה הפתוגנזה. בעוד שפנוטיפים משתנים עשויים להיות גלויים לעין, הניתוח המדויק של ההבדלים האיכותיים והכמותיים במבנים הסלולאריים הנגרמים על ידי אתגר הפתוגן הוא הכרחי להגדרת הבדלים משמעותיים בין דגימות ניסוייות ובקרה. גיבוש SG הוא תגובת מתח משמרת אבולוציונית המוביל לתגובות אנטי ויראליות ונחקרה זמן רב תוך שימוש בזיהומים ויראליים 1 . גיבוש SG משפיע גם מפלי איתות עשוי להיות conseq אחרים עדיין לא ידוע2 . אפיון תגובה זו ללחץ לפתוגנים, מלבד וירוסים, כגון פתוגנים חיידקיים, הוא כיום תחום מחקר חדש. לעת עתה, ניתוח כמותי ואיכותי של היווצרות SG עדיין לא נעשה שימוש שגרתי, גם במערכות ויראלי. כאן אנו מתארים שיטה פשוטה עבור גרימת ואפיון SG המבנה בתאי נגוע ובתאים נגועים פתוגן חיידקי cytosolic, אשר משפיע על היווצרות של SG בתגובה למתח אקסוגני שונים. ניתוח של היווצרות SG והרכב מושגת באמצעות מספר סמנים שונים SG גלאי נקודה התוספת של ICY, כלי ניתוח קוד פתוח התמונה.

Introduction

ויזואליזציה של אינטראקציות בין מחוללי מארח-פתוגן ברמה התאית היא שיטה רבת עוצמה להשגת תובנות לגבי אסטרטגיות פתוגניות ולזיהוי מסלולים סלולריים מרכזיים. ואכן, פתוגנים יכולים לשמש כלים כדי לאתר מטרות או מבנים סלולריים חשובים, כמו פתוגנים התפתחו כדי לחתור התהליכים הסלולר המרכזי כאסטרטגיה ההישרדות שלהם או התפשטות. ויזואליזציה של רכיבים סלולריים יכולה להיות מושגת על ידי רקומביננטי להביע fluorescently מתויג חלבונים מארח. בעוד זה מאפשר ניתוח בזמן אמת, הדור של שורות תאים עם ספציפית מתויג חלבונים מארח הוא מאוד מייגע עלול לגרום לתופעות לוואי לא רצויות. יותר נוח הוא זיהוי של גורמים סלולריים באמצעות נוגדנים ספציפיים, כי גורמים מרובים המארח ניתן לנתח בו זמנית ואחד אינו מוגבל לסוג תא מסוים. החיסרון הוא רק תצוגת סטטי ניתן ללכוד כמו ניתוח immunofluorescence מחייב fixat תא המארחיוֹן. עם זאת, יתרון חשוב של הדמיה immunofluorescence היא שזה בקלות משאיל את עצמו הן ניתוח איכותי וכמותי. זה בתורו יכול לשמש כדי להשיג הבדלים משמעותיים מבחינה סטטיסטית כדי לספק תובנות חדשות אינטראקציות מארח פתוגן.

ניתוח פלורסנט תוכניות ניתוח הם כלי ניתוחי רב עוצמה לביצוע 3D ו 4 D ניתוח. עם זאת, העלות הגבוהה של התוכנה ותחזוקה שלה לעשות שיטות המבוססות על תוכנות קוד פתוח חינם יותר אטרקטיבי. ניתוח תמונה זהיר באמצעות ביו ניתוח תוכנה הוא בעל ערך כפי שהוא מבסס ניתוח ויזואלי, כאשר הקצאת משמעות סטטיסטית, מגביר את הביטחון בנכונות פנוטיפ נתון. בעבר, SGs נותחו באמצעות תוכנת ImageJ חינם, אשר מחייב זיהוי ידני של SGS 4 בודדים. כאן אנו מספקים פרוטוקול אינדוקציה וניתוח של SG SG הסלולר בהקשר של bacזיהומים טרליים באמצעות קוד פתוח חופשי ניתוח תמונה תוכנה ICY (http://icy.bioimageanalysis.org). תוכנת ניתוח ביו התמונה יש מובנית גלאי נקודה תוכנית כי הוא מתאים מאוד לניתוח SG. זה מאפשר כוונון עדין של תהליך זיהוי אוטומטי באזורים ספציפיים של ריבית (ROIs). זה מתגבר על הצורך בניתוח ידני של SGs הפרט מסיר הטיה הדגימה.

רבים סביבתיים מדגיש לגרום היווצרות של SGS, שהם שלב cytosolic צפופה שלב, מבנים שאינם קרום של 0.2 – 5 מיקרומטר בקוטר 5 , 6 . תגובה סלולרית זו נשמרת בצורה אבולוציונית בשמרים, בצמחים וביונקים, והיא מתרחשת כאשר תרגום החלבון העולמי מעוכב. זה כרוך צבירה של מתחמי היזום התרגום נתקע לתוך SGs, אשר נחשבים מקומות החזקת עבור mRNAs translationally-inactive, המאפשר תרגום סלקטיבי של קבוצת משנה של mRNAs הסלולר.עם הסרת הלחץ, SGs לפזר את שיעורי הגלובלית של סינתזת החלבון לחדש. SGs מורכבים תרגום התארכות גורמים הארכה, חלבונים המעורבים RNA מטבוליזם, RNA מחייב חלבונים, כמו גם חלבונים פיגומים וגורמים המעורבים תא המארח איתות 2 , למרות ההרכב המדויק יכול להשתנות בהתאם ללחץ מוחל. גורמים סביבתיים אשר מעוררים היווצרות SG כוללים רעב חומצות אמינו, קרינה UV, הלם חום, הלם אוסמוטי, מתח reticulum endoplasmic, היפוקסיה וזיהום ויראלי 2 , 7 , 8 . התקדמות רבה נעשתה בהבנת האופן בו וירוסים מעוררים וגם מערערים את מבנה ה- SG, בעוד שרק מעט ידוע עדיין על האופן שבו פתוגנים אחרים, כגון פתוגנים, חיידקים פטרייתיים או פרוטוזנים, משפיעים על תגובת המתחים הסלולרית 1 , 7 .

שיגLla flexneri הוא גרם שלילי pathulative cytosolic הפתוגן של בני האדם ואת הגורם הסיבתי של שלשולים חמורים או shigellosis. Shigellosis הוא נטל בריאות הציבור העיקרי ומוביל 28,000 מקרי מוות בשנה אצל ילדים מתחת לגיל 5 של 9 , 10 . ס flexeneri מדביק את אפיתל הקולוני ומתפשט תא לתא ידי חטיפת המרכיבים cytoskeletal של המארח 11 , 12 . זיהום של אפיתל תומך שכפול של ס flexeneri בתוך cytosol אבל מקרופאגים נגועים למות דרך תהליך דלקתיות המוות הנקרא pyroptosis. זיהום מוביל לגיוס מסיבי של נויטרופילים ודלקת חמורה המלווה בחום, מתח חמצוני והרס רקמות. לכן, בעוד תאים נגועים כפופים ללחצים פנימיים המושרה על ידי זיהום, כגון הפרעות Golgi, מתח genotoxic ו סידור מחדש של cytoskeletalS, תאים נגועים הם גם נתון ללחץ סביבתי עקב תהליך דלקתי.

אפיון ההשפעה של זיהום S. flexneri על היכולת של תאים להגיב על מדגיש סביבתי באמצעות מספר סמנים SG הוכיח כי זיהום מוביל הבדלים איכותיים כמותיים הרכב SG 3 . עם זאת, מעט ידוע על פתוגנים חיידקים אחרים. כאן אנו מתארים מתודולוגיה של זיהום של תאים המארח עם הפתוגן cytosolic S. flexneri , הדגשת תאים עם מדגיש סביבתי שונים, תיוג של רכיבי SG, ואת ניתוח כמותי וכמותי של SG הרכב והרכב בהקשר של נגוע ותאים שאינם נגועים. שיטה זו מיושמת באופן נרחב פתוגנים חיידקים אחרים. בנוסף, ניתוח התמונה של היווצרות SG עשוי לשמש זיהומים על ידי וירוסים או פתוגנים אחרים. זה יכול לשמש כדי לנתח SGהיווצרות זיהום או השפעת זיהום על היווצרות SG בתגובה ללחץ אקסוגני.

Protocol

1. הכנת חיידקים ותאים מארחים העברה 12 או 14 מ"מ מכסה זכוכית מחליק גם 24 או 12 צלחות היטב, בהתאמה, עם פינצטה סטרילית, לספור אחד לכל תנאי הניסוי. לעקר אלה על ידי טיפול UV ברדס תרבות רקמה במשך 15 דקות. הערה: לכלול בארות בקרה ל?…

Representative Results

כדי להסביר ולהמחיש את הפרוטוקול המתואר בכתב יד זה, אנו מאופיין את התמונה של clotrimazole- המושרה SGS ב תאים hella נגוע או לא עם הפתוגן cytosolic S. flexneri . מתווה של הנוהל מוצג בתרשים 1 , וכולל נגיפי ואכזרית ס. Flexneri מפוספס על קונגו צלחות אדומות, …

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן מתאר את אינדוקציה, לוקליזציה וניתוח של SGS בתאים שאינם נגועים ותאים נגועים הפתוגן cytosolic S. flexneri בנוכחות או היעדר הלחץ אקסוגני. באמצעות תוכנת הדמיה חופשית, פרוטוקולים מאפשר ניתוח איכותי וכמותי מדויק של היווצרות SG לזהות וכתובת סטטיסטית ההבדלים …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

נ.ב. היא נמענת של ביל ומלינדה גייטס גרנט האתגר הגדול OPP1141322. PV נתמך על ידי קרן המדע הלאומית השוויצרית מוקדמות פוסטדוק ניידות מילגות רוסט-קנטאריני פוסט דוקטורט. PJS נתמך על ידי מענק HHMI ו- ERC-2013-ADG 339579-Decrypt.

Materials

Primary Antibodies
eIF3b (N20), origin goat Santa Cruz sc-16377 Robust and widely used SG marker. Cytosolic staining allows cell delineation. Dilution 1 in 300
eIF3b (A20), origin goat Santa Cruz sc-16378 Same target as eIF3b (N20) and in our hands was identical to eIF3b (N20). Dilution 1 in 300
eIF3A (D51F4), origin rabbit (MC: monoclonal) Cell Signaling 3411 Part of multiprotein eIF3 complex with eIF3b . Dilution 1 in 800
eIF4AI, origin goat Santa Cruz sc-14211 Recommended by (Ref # 13). Dilution 1 in 200
eIF4B, origin rabbit Abcam ab186856 Good stress granule marker in our hands. Dilution 1 in 300
eIF4B, origin rabbit Cell Signaling 3592 Recommended by Ref # 13. Dilution 1 in 100
eIF4G, origin rabbit Santa Cruz sc-11373 Widely used SG marker. (Ref # 13): may not work well in mouse cell lines. Dilution 1 in 300
G3BP1, origin rabbit (MC: monoclonal) BD Biosciences 611126 Widely used SG marker. Dilution 1 in 300
Tia-1, origin goat Santa Cruz sc-1751 Widely used SG marker. Can also be found in P bodies when SG are present (Ref # 13). Dilution 1 in 300
Alexa-conjugated Secondary Antibodies
A488 anti-goat , origin donkey Thermo Fisher A-11055 Cross absorbed. Dilution 1 in 500
A568 anti-goat, origin donkey Thermo Fisher A-11057 Cross absorbed. Dilution 1 in 500
A488 anti-mouse, origin donkey Thermo Fisher A-21202 Dilution 1 in 500
A568 anti-mouse, origin donkey Thermo Fisher A10037 Dilution 1 in 500
A647 anti-mouse, origin donkey Thermo Fisher A31571 Dilution 1 in 500
A488 anti-rabbit, origin donkey Thermo Fisher A-21206 Dilution 1 in 500
A568 anti-rabbit, origin donkey Thermo Fisher A10042 Dilution 1 in 500
Other Reagents
Shigella flexneri Available from various laboratories by request
Tryptone Casein Soya (TCS) broth BD Biosciences 211825 Standard growth medium for Shigella, application – bacterial growth
TCS agar BD Biosciences 236950 Standard growth agar for Shigella, application – bacterial growth
Congo red SERVA Electrophoresis GmbH 27215.01 Distrimination tool for Shigell that have lost the virulence plasmid, application – bacterial growth
Poly L lysine Sigma-Aldrich P1274 Useful to coating bacteria to increase infection, application – infection
Gentamicin Sigma-Aldrich G1397 Selective killing of extracellular but not cytosolic bacteria, application – infection
HEPES Life Technologies 15630-056 PH buffer useful when cells are incubated at room-temperature, application – cell culture
DMEM Life Technologies 31885 Standard culture medium for HeLa cells, application – cell culture
Fetal calf serum Biowest S1810-100 5% supplementation used for HeLa cell culture medium, application – cell culture
Non-essential amino acids Life Technologies 11140 1/100 dilution used for HeLa cell culture medium, application – cell culture
DMSO Sigma-Aldrich D2650 Reagent diluent, application – cell culture
Sodium arsenite Sigma-Aldrich S7400 Potent stress granule inducer (Note: highly toxic, special handling and disposal required), application – stress inducer
Clotrimazole Sigma-Aldrich C6019 Potent stress granule inducer (Note:health hazard, special handling and disposal required), application – stress inducer
PFA Electron Microscopy Scences 15714 4% PFA is used for standard fixation of cells, application – fixation
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 Used at 0.03% for permeabilizationof host cells before immunofluorescent staining, application – permeabilization
A647-phalloidin Thermo Fisher A22287 Dilution is at 1/40, best added during 2ary antibody staining, application – staining
DAPI Sigma-Aldrich D9542 Nucleid acid stain used to visualize both the host nucleus and bacteria, application – staining
Parafilm Sigma-Aldrich BR701501 Paraffin film useful for immunofluorescent staining of coverslips, application – staining
Prolong Gold Thermo Fisher 36930 Robust mounting medium that works well for most fluorophores , application – mounting
Mowiol Sigma-Aldrich 81381 Cheap and robust mounting medium that works well for most fluorophores, application – mounting
24-well cell culture plate Sigma-Aldrich CLS3527 Standard tissue culture plates, application – cell culture
12-mm glass coverslips NeuVitro 1001/12 Cell culture support for immunofluorescent applications, application – cell support
forceps Sigma-Aldrich 81381 Cheap and obust mounting medium that works well for most fluorophores, application – mounting
Programs and Equipment
Prism GraphPad Software Data analysisand graphing program with robust statistical test options, application – data analysis
Leica SP5 Leica Microsystems Confocal microsope, application – image acquisition
Imaris Bitplane Professional image analysis program, application – data analysis
Excel Microsoft Data analysis and graphing program, application – data analysis

References

  1. Reineke, L. C., Lloyd, R. E. Diversion of stress granules and P-bodies during viral infection. Virology. 436 (2), 255-267 (2013).
  2. Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase. Trends Biochem Sci. 38 (10), 494-506 (2013).
  3. Vonaesch, P., Campbell-Valois, F. -. X., Dufour, A., Sansonetti, P. J., Schnupf, P. Shigella flexneri modulates stress granule composition and inhibits stress granule aggregation. Cell Microbiol. 18 (7), 982-997 (2016).
  4. Kolobova, E., Efimov, A., et al. Microtubule-dependent association of AKAP350A and CCAR1 with RNA stress granules. Exp Cell Res. 315 (3), 542-555 (2009).
  5. Anderson, P., Kedersha, N. Stress granules: the Tao of RNA triage. Trends in biochemical sciences. 33 (3), 141-150 (2008).
  6. Anderson, P., Kedersha, N. Stressful initiations. J Cell Sci. 115, 3227-3234 (2002).
  7. Mohr, I., Sonenberg, N. Host translation at the nexus of infection and immunity. Cell Host Microbe. 12 (4), 470-483 (2012).
  8. Hu, S., Claud, E. C., Musch, M. W., Chang, E. B. Stress granule formation mediates the inhibition of colonic Hsp70 translation by interferon- and tumor necrosis factor. Am J Physiol Gastointest Liver Physiol. 298 (4), 481-492 (2010).
  9. Barry, E. M., Pasetti, M. F., Sztein, M. B., Fasano, A., Kotloff, K. L., Levine, M. M. Progress and pitfalls in Shigella vaccine research. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (4), 245-255 (2013).
  10. Lanata, C. F., Fischer-Walker, C. L., et al. Global Causes of Diarrheal Disease Mortality in Children. PloS One. 8 (9), 72788 (2013).
  11. Ashida, H., Ogawa, M., et al. Shigella deploy multiple countermeasures against host innate immune responses. Curr Opin Microbiol. 14 (1), 16-23 (2011).
  12. Ashida, H., Ogawa, M., Mimuro, H., Kobayashi, T., Sanada, T., Sasakawa, C. Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system. Curr Opin Immunol. 23 (4), 448-455 (2011).
  13. Kedersha, N., Anderson, P. Mammalian stress granules and processing bodies. Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).
  14. Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria. Nat Re. Micro. 7 (5), 333-340 (2009).

Play Video

Cite This Article
Vonaesch, P., Sansonetti, P. J., Schnupf, P. Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (125), e55536, doi:10.3791/55536 (2017).

View Video