Summary

Analyse d'immunofluorescence de la formation de granules de stress après le dépistage bactérien des cellules de mammifères

Published: July 03, 2017
doi:

Summary

Nous décrivons une méthode pour l'analyse qualitative et quantitative de la formation de granules de stress dans des cellules de mammifères après que les cellules sont confrontées à des bactéries et à un certain nombre de contraintes différentes. Ce protocole peut être appliqué pour étudier la réponse des granules de stress cellulaire dans une large gamme d'interactions hôtes-bactéries.

Abstract

L'imagerie fluorescente des composants cellulaires est un outil efficace pour étudier les interactions hôte-pathogène. Les agents pathogènes peuvent affecter de nombreuses caractéristiques différentes des cellules infectées, y compris l'ultrastructure des organelles, l'organisation du réseau cytosquelettique, ainsi que les processus cellulaires tels que la formation du granulé du stress (SG). La caractérisation de la façon dont les agents pathogènes subversent les processus hôtes est une partie importante et intégrante du domaine de la pathogenèse. Bien que les phénotypes variables puissent être facilement visibles, l'analyse précise des différences qualitatives et quantitatives dans les structures cellulaires induites par le défi des agents pathogènes est essentielle pour définir des différences statistiquement significatives entre les échantillons expérimental et les témoins. La formation du SG est une réponse au stress évolutive qui conduit à des réponses antivirales et a longtemps été étudiée en utilisant des infections virales 1 . La formation SG affecte également les cascades de signalisation et peut avoir d'autres conséquences encore inconnues2 . La caractérisation de cette réponse au stress par des agents pathogènes autres que les virus, tels que les agents pathogènes bactériens, est actuellement un domaine émergent de recherche 3 . Pour l'instant, l'analyse quantitative et qualitative de la formation SG n'est pas encore utilisée de manière routinière, même dans les systèmes virales. Nous décrivons ici une méthode simple pour induire et caractériser la formation de SG dans les cellules non infectées et dans les cellules infectées par un agent pathogène bactérien cytosolique, ce qui affecte la formation de SG en réponse à divers contraintes exogènes. L'analyse de la formation et de la composition du SG est obtenue en utilisant un certain nombre de marqueurs SG différents et le plug-in détecteur spot de ICY, un outil d'analyse d'image open source.

Introduction

La visualisation des interactions hôte-pathogène au niveau cellulaire est une méthode puissante pour obtenir des idées sur les stratégies pathogènes et pour identifier les voies cellulaires clés. En effet, les agents pathogènes peuvent être utilisés comme outils pour identifier des cibles ou des structures cellulaires importantes, car les agents pathogènes ont évolué pour subvertir les processus cellulaires centraux en tant que stratégie pour leur propre survie ou propagation. La visualisation des composants cellulaires peut être obtenue par l'expression recombinante de protéines hôtes marquées par fluorescence. Bien que cela permette une analyse en temps réel, la génération de lignées cellulaires avec des protéines hôtes spécifiquement étiquetées est très laborieuse et peut entraîner des effets secondaires indésirables. Plus pratique est la détection de facteurs cellulaires à l'aide d'anticorps spécifiques, car plusieurs facteurs d'hôte peuvent être analysés simultanément et l'un n'est pas limité à un type de cellule particulier. Un inconvénient est que seule une vue statique peut être capturée car l'analyse d'immunofluorescence nécessite une fixation de cellule hôteion. Cependant, un avantage important de l'imagerie immunofluorescente est qu'il se prête facilement à l'analyse qualitative et quantitative. Ceci à son tour peut être utilisé pour obtenir des différences statistiquement significatives pour fournir de nouvelles idées sur les interactions hôte-pathogène.

Les programmes d'analyse d'image fluorescente sont des outils analytiques puissants pour effectuer des analyses 3D et 4D. Cependant, le coût élevé du logiciel et de sa maintenance rend les méthodes basées sur des logiciels open source gratuits plus largement attrayantes. Une analyse d'image minutieuse utilisant un logiciel de bioannalyse est précieuse car elle confirme l'analyse visuelle et, lorsqu'on attribue des significations statistiques, augmente la confiance dans l'exactitude d'un phénotype donné. Auparavant, les SG ont été analysés à l'aide du logiciel ImageJ gratuit, ce qui nécessite l'identification manuelle des SG individuels 4 . Ici, nous fournissons un protocole pour l'induction et l'analyse de la formation de SG cellulaire dans le contexte du bacInfections tertiaires en utilisant le logiciel d'analyse de bio-image libre open source ICY (http://icy.bioimageanalysis.org). Le logiciel d'analyse de bio-image dispose d'un programme intégré de détection de points qui est très adapté à l'analyse SG. Il permet le réglage précis du processus de détection automatisé dans les régions d'intérêt spécifiées (ROI). Cela surmonte la nécessité d'une analyse manuelle des SG individuels et supprime le biais d'échantillonnage.

Beaucoup de contraintes environnementales induisent la formation de SG, qui sont des structures cytosoliques, non membranées densément denses, de 0,2 à 5 μm de diamètre 5 , 6 . Cette réponse cellulaire est évolutive conservée dans les levures, les plantes et les mammifères et se produit lorsque la traduction globale des protéines est inhibée. Il implique l'agrégation des complexes d'initiation de traduction bloqués en SG, qui sont considérés comme des lieux de maintien pour les ARNm traductionnellement inactifs, permettant la traduction sélective d'un sous-ensemble d'ARNm cellulaires.Après élimination du stress, les SG se dissolvent et les taux globaux de synthèse des protéines reprennent. Les SG sont composés de facteurs d'initiation à l'allongement de la traduction, des protéines impliquées dans le métabolisme de l'ARN, des protéines liées à l'ARN, ainsi que des protéines d'échafaudages et des facteurs impliqués dans la signalisation 2 de la cellule hôte, bien que la composition exacte puisse varier en fonction du stress appliqué. Les facteurs environnementaux qui induisent la formation de SG comprennent la famine des acides aminés, l'irradiation UV, les chocs thermiques, le choc osmotique, le stress du réticulum endoplasmique, l'hypoxie et l'infection virale 2 , 7 , 8 . De nombreux progrès ont été réalisés dans la compréhension de la façon dont les virus induisent et subent également la formation de SG, alors que peu de choses sont encore connues sur la façon dont d'autres agents pathogènes, tels que les agents pathogènes bactériens, fongiques ou protozoaires, affectent cette réponse de stress cellulaire 1 , 7 .

ShigeLla flexneri est un agent pathogène cytosolique facultatif gram-négatif des humains et l'agent causal de la diarrhée sévère ou de la shigellose. La shigellose est un fardeau majeur de la santé publique et entraîne 28 000 décès par année chez les enfants de moins de 5 ans 9 , 10 ans . S. flexneri infecte l'épithélium colique et se propage de cellule à cellule en détournant les composants cytosquelettiques de l'hôte 11 , 12 . L'infection de l'épithélium soutient la réplication de S. flexneri dans le cytosol, mais les macrophages infectés meurent à travers un processus de mort inflammatoire cellulaire appelé pyroptose. L'infection entraîne un recrutement massif de neutrophiles et une inflammation sévère accompagnée de chaleur, de stress oxydatif et de destruction des tissus. Ainsi, alors que les cellules infectées sont soumises à des contraintes internes induites par une infection, telles que la perturbation de Golgi, le stress génotoxique et le réarrangement cytosquelettiqueS, les cellules infectées sont également soumises à des contraintes environnementales dues au processus inflammatoire.

La caractérisation de l'effet de l'infection par S. flexneri sur la capacité des cellules à répondre aux contraintes environnementales en utilisant un certain nombre de marqueurs SG a démontré que l'infection entraîne des différences qualitatives et quantitatives dans la composition SG 3 . Cependant, on connaît peu d'autres agents pathogènes bactériens. Nous décrivons ici une méthodologie pour l'infection des cellules hôtes avec le pathogène cytosolique S. flexneri , le stress des cellules avec différents contraintes environnementales, l'étiquetage des composants SG et l'analyse qualitative et quantitative de la formation et de la composition du SG dans le contexte des infections Et des cellules non infectées. Cette méthode est largement applicable à d'autres agents pathogènes bactériens. En outre, l'analyse d'image de la formation SG peut être utilisée pour les infections par des virus ou d'autres agents pathogènes. Il peut être utilisé pour analyser SGFormation sur l'infection ou l'effet de l'infection sur la formation de SG en réponse à des contraintes exogènes.

Protocol

1. Préparation des bactéries et des cellules hôtes Remettre le couvercle de verre de 12 ou 14 mm dans des plaques de 24 ou 12 puits, respectivement, avec une pince stérile, en comptant un puits par état expérimental. Stérilisez-les par traitement UV dans un capuchon de culture tissulaire pendant 15 min. REMARQUE: Inclure les puits de contrôle pour la provocation bactérienne et pour l'induction SG par des contraintes exogènes. Pour une plaque de 24 puits avec des lamelles de 12 m…

Representative Results

Pour expliquer et démontrer le protocole décrit dans ce manuscrit, nous avons caractérisé l'image des SGs induites par le clotrimazole dans les cellules HeLa infectées ou non avec le pathogène cytosolique S. flexneri . Un schéma de la procédure est présenté dans la figure 1 , et comprend S. flexneri virulent et avirulent rayé sur les plaques rouges du Congo, la préparation des bactéries, l'infection, l'ajout de stre…

Discussion

Le protocole décrit ici décrit l'induction, la localisation et l'analyse des SG dans les cellules non infectées et les cellules infectées par le pathogène cytosolique S. flexneri en présence ou en l'absence de stress exogène. En utilisant un logiciel d'imagerie gratuit, les protocoles permettent une analyse qualitative et quantitative précise de la formation SG pour identifier et analyser statistiquement les différences dans les phénotypes donnés.

Il exist…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

PS est récipiendaire de la subvention Grand Challenge de Bill et Melinda Gates OPP1141322. PV a été soutenu par une bourse de mobilité postdocale de la Fondation nationale de la science nationale suisse et une bourse postdoctorale Roux-Cantarini. PJS est soutenu par une subvention HHMI et ERC-2013-ADG 339579-Decrypt.

Materials

Primary Antibodies
eIF3b (N20), origin goat Santa Cruz sc-16377 Robust and widely used SG marker. Cytosolic staining allows cell delineation. Dilution 1 in 300
eIF3b (A20), origin goat Santa Cruz sc-16378 Same target as eIF3b (N20) and in our hands was identical to eIF3b (N20). Dilution 1 in 300
eIF3A (D51F4), origin rabbit (MC: monoclonal) Cell Signaling 3411 Part of multiprotein eIF3 complex with eIF3b . Dilution 1 in 800
eIF4AI, origin goat Santa Cruz sc-14211 Recommended by (Ref # 13). Dilution 1 in 200
eIF4B, origin rabbit Abcam ab186856 Good stress granule marker in our hands. Dilution 1 in 300
eIF4B, origin rabbit Cell Signaling 3592 Recommended by Ref # 13. Dilution 1 in 100
eIF4G, origin rabbit Santa Cruz sc-11373 Widely used SG marker. (Ref # 13): may not work well in mouse cell lines. Dilution 1 in 300
G3BP1, origin rabbit (MC: monoclonal) BD Biosciences 611126 Widely used SG marker. Dilution 1 in 300
Tia-1, origin goat Santa Cruz sc-1751 Widely used SG marker. Can also be found in P bodies when SG are present (Ref # 13). Dilution 1 in 300
Alexa-conjugated Secondary Antibodies
A488 anti-goat , origin donkey Thermo Fisher A-11055 Cross absorbed. Dilution 1 in 500
A568 anti-goat, origin donkey Thermo Fisher A-11057 Cross absorbed. Dilution 1 in 500
A488 anti-mouse, origin donkey Thermo Fisher A-21202 Dilution 1 in 500
A568 anti-mouse, origin donkey Thermo Fisher A10037 Dilution 1 in 500
A647 anti-mouse, origin donkey Thermo Fisher A31571 Dilution 1 in 500
A488 anti-rabbit, origin donkey Thermo Fisher A-21206 Dilution 1 in 500
A568 anti-rabbit, origin donkey Thermo Fisher A10042 Dilution 1 in 500
Other Reagents
Shigella flexneri Available from various laboratories by request
Tryptone Casein Soya (TCS) broth BD Biosciences 211825 Standard growth medium for Shigella, application – bacterial growth
TCS agar BD Biosciences 236950 Standard growth agar for Shigella, application – bacterial growth
Congo red SERVA Electrophoresis GmbH 27215.01 Distrimination tool for Shigell that have lost the virulence plasmid, application – bacterial growth
Poly L lysine Sigma-Aldrich P1274 Useful to coating bacteria to increase infection, application – infection
Gentamicin Sigma-Aldrich G1397 Selective killing of extracellular but not cytosolic bacteria, application – infection
HEPES Life Technologies 15630-056 PH buffer useful when cells are incubated at room-temperature, application – cell culture
DMEM Life Technologies 31885 Standard culture medium for HeLa cells, application – cell culture
Fetal calf serum Biowest S1810-100 5% supplementation used for HeLa cell culture medium, application – cell culture
Non-essential amino acids Life Technologies 11140 1/100 dilution used for HeLa cell culture medium, application – cell culture
DMSO Sigma-Aldrich D2650 Reagent diluent, application – cell culture
Sodium arsenite Sigma-Aldrich S7400 Potent stress granule inducer (Note: highly toxic, special handling and disposal required), application – stress inducer
Clotrimazole Sigma-Aldrich C6019 Potent stress granule inducer (Note:health hazard, special handling and disposal required), application – stress inducer
PFA Electron Microscopy Scences 15714 4% PFA is used for standard fixation of cells, application – fixation
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 Used at 0.03% for permeabilizationof host cells before immunofluorescent staining, application – permeabilization
A647-phalloidin Thermo Fisher A22287 Dilution is at 1/40, best added during 2ary antibody staining, application – staining
DAPI Sigma-Aldrich D9542 Nucleid acid stain used to visualize both the host nucleus and bacteria, application – staining
Parafilm Sigma-Aldrich BR701501 Paraffin film useful for immunofluorescent staining of coverslips, application – staining
Prolong Gold Thermo Fisher 36930 Robust mounting medium that works well for most fluorophores , application – mounting
Mowiol Sigma-Aldrich 81381 Cheap and robust mounting medium that works well for most fluorophores, application – mounting
24-well cell culture plate Sigma-Aldrich CLS3527 Standard tissue culture plates, application – cell culture
12-mm glass coverslips NeuVitro 1001/12 Cell culture support for immunofluorescent applications, application – cell support
forceps Sigma-Aldrich 81381 Cheap and obust mounting medium that works well for most fluorophores, application – mounting
Programs and Equipment
Prism GraphPad Software Data analysisand graphing program with robust statistical test options, application – data analysis
Leica SP5 Leica Microsystems Confocal microsope, application – image acquisition
Imaris Bitplane Professional image analysis program, application – data analysis
Excel Microsoft Data analysis and graphing program, application – data analysis

References

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Cite This Article
Vonaesch, P., Sansonetti, P. J., Schnupf, P. Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (125), e55536, doi:10.3791/55536 (2017).

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