Summary

تحليل المناعي من الإجهاد الحبيبية تشكيل بعد تحدي البكتيريا من خلايا الثدييات

Published: July 03, 2017
doi:

Summary

نحن تصف طريقة للتحليل النوعي والكمي لتشكيل الحبيبة الإجهاد في خلايا الثدييات بعد تحدي الخلايا مع البكتيريا وعدد من الضغوط المختلفة. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول للتحقيق في الاستجابة الحبيبية الإجهاد الحبيبية في مجموعة واسعة من التفاعلات المضيف البكتيرية.

Abstract

التصوير الفلورسنت من المكونات الخلوية هو أداة فعالة للتحقيق التفاعلات المضيف الممرض. يمكن أن تؤثر العوامل المسببة للأمراض على العديد من الخصائص المختلفة للخلايا المصابة، بما في ذلك بنية الخلايا العضوية، وتنظيم الشبكة الخلوية الهيكلية، فضلا عن العمليات الخلوية مثل تشكيل الإجهاد الحبيبي (سغ). توصيف كيفية مسببات الأمراض تخريب العمليات المضيف هو جزء مهم ومتكامل من مجال التسبب. في حين أن المظاهر المتغيرة قد تكون مرئية بسهولة، والتحليل الدقيق للاختلافات النوعية والكمية في الهياكل الخلوية الناجمة عن التحدي الممرض ضروري لتحديد الاختلافات ذات دلالة إحصائية بين العينات التجريبية والسيطرة. تشكيل سغ هو استجابة الإجهاد الحفاظ على التطور الذي يؤدي إلى ردود الفعل المضادة للفيروسات، وقد تم التحقيق منذ فترة طويلة باستخدام العدوى الفيروسية 1 . كما يؤثر تشكيل سغ على شلالات التشوير وقد يكون له تأثير آخر غير معروف2 . إن توصيف هذه الاستجابة للإجهاد لمسببات الأمراض الأخرى غير الفيروسات، مثل مسببات الأمراض البكتيرية، يعد حاليا مجالا ناشئا للبحوث 3 . في الوقت الراهن، لم يتم بعد استخدام التحليل الكمي والنوعي لتشكيل سغ بشكل روتيني، حتى في النظم الفيروسية. نحن هنا وصف طريقة بسيطة لإحداث وتوصيف تكوين سغ في الخلايا غير المصابة وفي الخلايا المصابة مع الممرض البكتيري عصاري خلوي، مما يؤثر على تشكيل سغس ردا على الضغوط الخارجية المختلفة. ويتحقق تحليل تشكيل سغ وتكوينها باستخدام عدد من علامات سغ مختلفة وكاشف بقعة المكونات في من إيسي، أداة تحليل صورة مفتوحة المصدر.

Introduction

تصور التفاعلات الممرض المضيف على مستوى الخلوية هو وسيلة قوية للحصول على رؤى في الاستراتيجيات المسببة للأمراض وتحديد مسارات الخلوية الرئيسية. في الواقع، يمكن استخدام مسببات الأمراض كأدوات لتحديد الأهداف الخلوية الهامة أو الهياكل، كما تطورت مسببات الأمراض لتخريب العمليات الخلوية المركزية كاستراتيجية لبقائهم أو نشرهم. التصور من المكونات الخلوية لا يمكن أن يتحقق من خلال إعادة التعبير عن كومبوتانتلي فلورزنتلي الموسومة المضيف البروتينات. في حين أن هذا يسمح للتحليل في الوقت الحقيقي، وتوليد خطوط الخلايا مع البروتينات المضيف الموسومة على وجه التحديد هو شاقة للغاية وقد يؤدي إلى آثار جانبية غير مرغوب فيها. أكثر ملاءمة هو الكشف عن العوامل الخلوية باستخدام أجسام مضادة محددة، لأن العوامل المضيفة متعددة يمكن تحليلها في وقت واحد واحد لا يقتصر على نوع معين من الخلايا. العيب هو أنه يمكن التقاط فقط عرض ثابت كما تحليل المناعي يستلزم الخلية المضيفة فيكاتأيون. ومع ذلك، فإن ميزة هامة للتصوير المناعي هو أنه يفسح المجال بسهولة لكلا التحليل النوعي والكمي. وهذا بدوره يمكن أن تستخدم للحصول على فروق ذات دلالة إحصائية لتوفير رؤى جديدة في التفاعلات الممرض المضيف.

برامج تحليل الصور الفلورية هي أدوات تحليلية قوية لأداء تحليل 3D و 4 D. ومع ذلك، فإن ارتفاع تكلفة البرمجيات وصيانة لها جعل الأساليب على أساس البرمجيات الحرة مفتوحة المصدر أكثر جاذبية على نطاق واسع. تحليل الصور بعناية باستخدام برنامج التحليل الحيوي هو قيمة كما أنه يدعم التحليل البصري، وعند تعيين دلالات إحصائية، يزيد من الثقة في صحة النمط الظاهري معين. في السابق، تم تحليل سغس باستخدام برنامج إيماجيج مجانا، الأمر الذي يتطلب تحديد اليدوي من سغس الفردية 4 . هنا نحن نقدم بروتوكول لتحريض وتحليل تشكيل سغ الخلوية في سياق باكالالتهابات الشريانية باستخدام الحرة المصدر المفتوح برنامج تحليل الصور الحيوية إيسي (http://icy.bioimageanalysis.org). برنامج تحليل الصور الحيوية لديه برنامج الكشف عن بقعة المدمج الذي هو مناسبة للغاية لتحليل سغ. فإنه يسمح لصقل عملية الكشف الآلي في مناطق محددة من الفائدة (روي). وهذا يتغلب على الحاجة إلى التحليل اليدوي لفرادى لجان الدراسات ويزيل التحيز في أخذ العينات.

العديد من الضغوط البيئية تحفز تشكيل سغس، والتي هي مرحلة عصاري خلوي كثيفة، والهياكل غير غشائية من 0.2 – 5 ميكرون في القطر 5 ، 6 . يتم الحفاظ على هذه الاستجابة الخلوية بشكل تطوري في الخميرة والنباتات والثدييات ويحدث عندما يتم تثبيط ترجمة البروتين العالمية. أنه ينطوي على تجميع مجمعات بدء الترجمة المتوقفة في سغس، والتي تعتبر أماكن عقد ل مرناس ترانزلاتيونالي-إناكتيف، مما يتيح الترجمة الانتقائية لمجموعة فرعية من مرناس الخلوية.عند إزالة الإجهاد، سغس تذوب والأسعار العالمية لاستئصال البروتين استئناف. وتتكون سغس من عوامل بدء استطالة الترجمة والبروتينات المشاركة في استقلاب الحمض النووي الريبي، والبروتينات ملزمة رنا، وكذلك البروتينات السقالات والعوامل التي تشارك في إشارة الخلية المضيفة 2 ، على الرغم من أن التكوين الدقيق يمكن أن تختلف اعتمادا على الإجهاد المطبق. العوامل البيئية التي تحفز تشكيل سغ تشمل الجوع الحمضي الأميني، الأشعة فوق البنفسجية التشعيع، صدمة الحرارة، صدمة تناضحي، التوتر الشبكة إندوبلازميك، نقص الأكسجة والعدوى الفيروسية 2 ، 7 ، 8 . وقد تم إحراز تقدم كبير في فهم كيفية تحريض الفيروسات وتهريب أيضا تشكيل سغ، في حين لا يزال قليلا لا يزال يعرف عن كيفية مسببات الأمراض الأخرى، مثل مسببات الأمراض البكتيرية، الفطرية أو بروتوزوان، تؤثر على هذه الاستجابة الإجهاد الخلوي 1 ، 7 .

شيجيلا فليكسنيري هو سلبي غرام سلبية الممرض خلوي خلوي للبشر والعامل المسبب للإسهال الشديد أو شيجيلوسيس. ويشكل الشيغلوسيس عبئا رئيسيا على الصحة العامة ويؤدي إلى وفاة 000 28 طفل سنويا دون سن الخامسة من العمر 9 سنوات . S. فليكسنيري يصيب ظهارة القولون وينتشر خلية إلى خلية عن طريق اختراق مكونات الهيكل الخلوي المضيف 11 ، 12 . العدوى من ظهارة يدعم تكرار S. فليكسنيري داخل السيتوسول ولكن الضامة المصابة يموت من خلال عملية موت الخلايا الالتهابية يسمى بايروبتوسيس. العدوى يؤدي إلى تجنيد واسعة من العدلات والالتهاب الحاد الذي يرافقه الحرارة والإجهاد التأكسدي وتدمير الأنسجة. وهكذا، في حين أن الخلايا المصابة عرضة للضغوط الداخلية الناجمة عن العدوى، مثل اضطراب جولجي، والإجهاد السامة للخلايا وإعادة ترتيب الهيكل الخلويs، والخلايا المصابة تتعرض أيضا للضغوط البيئية بسبب العملية الالتهابية.

توصيف تأثير العدوى S. فليكسنيري على قدرة الخلايا على الاستجابة للضغوط البيئية باستخدام عدد من علامات سغ أثبتت أن العدوى يؤدي إلى الاختلافات النوعية والكمية في تكوين سغ 3 . ومع ذلك، لا يعرف سوى القليل عن مسببات الأمراض البكتيرية الأخرى. نحن هنا وصف منهجية للعدوى من الخلايا المضيفة مع الممرض عصاري خلوي S. فليكسنيري ، وتشديد الخلايا مع الضغوط البيئية المختلفة، ووضع العلامات من مكونات سغ، والتحليل النوعي والكمي لتشكيل سغ وتكوينها في سياق المصابين والخلايا غير المصابة. هذا الأسلوب ينطبق على نطاق واسع لمسببات الأمراض البكتيرية الأخرى. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام تحليل الصورة لتشكيل سغ للعدوى عن طريق الفيروسات أو مسببات الأمراض الأخرى. ويمكن استخدامه لتحليل سغتشكيل على العدوى أو تأثير العدوى على تشكيل سغ ردا على الضغوط الخارجية.

Protocol

1. إعداد البكتيريا والخلايا المضيفة نقل 12 أو 14 ملم غطاء الزجاج زلات في أي لوحات 24- أو 12 جيدا، على التوالي، مع ملاقط معقمة، عد بئر واحد في حالة تجريبية. تعقيم هذه عن طريق العلاج بالأشعة فوق البنفسجية في هود ثقافة الأنسجة ?…

Representative Results

لشرح وإثبات البروتوكول الموصوفة في هذه المخطوطة، وصفنا صورة سغس كلوتريمازول الناجم عن خلايا هيلا المصابة أم لا مع الممرض عصاري خلوي S. فليكسنيري . يتم عرض مخطط من هذا الإجراء في الشكل 1 ، ويشمل الفوعة ومضطربة S. فليكسنيري شدد…

Discussion

بروتوكول موجزة هنا يصف تحريض، توطين، وتحليل سغس في الخلايا غير المصابة والخلايا المصابة مع الممرض عصاري خلوي S. فليكسنيري في وجود أو عدم وجود إجهاد خارجي. باستخدام برامج التصوير مجانا، والبروتوكولات يسمح للتحليل النوعي والكمي الدقيق لتشكيل سغ لتحديد وإحصائيا م…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

بس هو المستفيد من بيل وميليندا غيتس جراند التحدي منحة OPP1141322. وقد دعمت بف من قبل مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية في وقت مبكر زمالة بوستدوك التنقل وزميلة رو-كانتاريني ما بعد الدكتوراه. يتم دعم بس من قبل منحة همي و إرك-2013-أدغ 339579 فك.

Materials

Primary Antibodies
eIF3b (N20), origin goat Santa Cruz sc-16377 Robust and widely used SG marker. Cytosolic staining allows cell delineation. Dilution 1 in 300
eIF3b (A20), origin goat Santa Cruz sc-16378 Same target as eIF3b (N20) and in our hands was identical to eIF3b (N20). Dilution 1 in 300
eIF3A (D51F4), origin rabbit (MC: monoclonal) Cell Signaling 3411 Part of multiprotein eIF3 complex with eIF3b . Dilution 1 in 800
eIF4AI, origin goat Santa Cruz sc-14211 Recommended by (Ref # 13). Dilution 1 in 200
eIF4B, origin rabbit Abcam ab186856 Good stress granule marker in our hands. Dilution 1 in 300
eIF4B, origin rabbit Cell Signaling 3592 Recommended by Ref # 13. Dilution 1 in 100
eIF4G, origin rabbit Santa Cruz sc-11373 Widely used SG marker. (Ref # 13): may not work well in mouse cell lines. Dilution 1 in 300
G3BP1, origin rabbit (MC: monoclonal) BD Biosciences 611126 Widely used SG marker. Dilution 1 in 300
Tia-1, origin goat Santa Cruz sc-1751 Widely used SG marker. Can also be found in P bodies when SG are present (Ref # 13). Dilution 1 in 300
Alexa-conjugated Secondary Antibodies
A488 anti-goat , origin donkey Thermo Fisher A-11055 Cross absorbed. Dilution 1 in 500
A568 anti-goat, origin donkey Thermo Fisher A-11057 Cross absorbed. Dilution 1 in 500
A488 anti-mouse, origin donkey Thermo Fisher A-21202 Dilution 1 in 500
A568 anti-mouse, origin donkey Thermo Fisher A10037 Dilution 1 in 500
A647 anti-mouse, origin donkey Thermo Fisher A31571 Dilution 1 in 500
A488 anti-rabbit, origin donkey Thermo Fisher A-21206 Dilution 1 in 500
A568 anti-rabbit, origin donkey Thermo Fisher A10042 Dilution 1 in 500
Other Reagents
Shigella flexneri Available from various laboratories by request
Tryptone Casein Soya (TCS) broth BD Biosciences 211825 Standard growth medium for Shigella, application – bacterial growth
TCS agar BD Biosciences 236950 Standard growth agar for Shigella, application – bacterial growth
Congo red SERVA Electrophoresis GmbH 27215.01 Distrimination tool for Shigell that have lost the virulence plasmid, application – bacterial growth
Poly L lysine Sigma-Aldrich P1274 Useful to coating bacteria to increase infection, application – infection
Gentamicin Sigma-Aldrich G1397 Selective killing of extracellular but not cytosolic bacteria, application – infection
HEPES Life Technologies 15630-056 PH buffer useful when cells are incubated at room-temperature, application – cell culture
DMEM Life Technologies 31885 Standard culture medium for HeLa cells, application – cell culture
Fetal calf serum Biowest S1810-100 5% supplementation used for HeLa cell culture medium, application – cell culture
Non-essential amino acids Life Technologies 11140 1/100 dilution used for HeLa cell culture medium, application – cell culture
DMSO Sigma-Aldrich D2650 Reagent diluent, application – cell culture
Sodium arsenite Sigma-Aldrich S7400 Potent stress granule inducer (Note: highly toxic, special handling and disposal required), application – stress inducer
Clotrimazole Sigma-Aldrich C6019 Potent stress granule inducer (Note:health hazard, special handling and disposal required), application – stress inducer
PFA Electron Microscopy Scences 15714 4% PFA is used for standard fixation of cells, application – fixation
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 Used at 0.03% for permeabilizationof host cells before immunofluorescent staining, application – permeabilization
A647-phalloidin Thermo Fisher A22287 Dilution is at 1/40, best added during 2ary antibody staining, application – staining
DAPI Sigma-Aldrich D9542 Nucleid acid stain used to visualize both the host nucleus and bacteria, application – staining
Parafilm Sigma-Aldrich BR701501 Paraffin film useful for immunofluorescent staining of coverslips, application – staining
Prolong Gold Thermo Fisher 36930 Robust mounting medium that works well for most fluorophores , application – mounting
Mowiol Sigma-Aldrich 81381 Cheap and robust mounting medium that works well for most fluorophores, application – mounting
24-well cell culture plate Sigma-Aldrich CLS3527 Standard tissue culture plates, application – cell culture
12-mm glass coverslips NeuVitro 1001/12 Cell culture support for immunofluorescent applications, application – cell support
forceps Sigma-Aldrich 81381 Cheap and obust mounting medium that works well for most fluorophores, application – mounting
Programs and Equipment
Prism GraphPad Software Data analysisand graphing program with robust statistical test options, application – data analysis
Leica SP5 Leica Microsystems Confocal microsope, application – image acquisition
Imaris Bitplane Professional image analysis program, application – data analysis
Excel Microsoft Data analysis and graphing program, application – data analysis

References

  1. Reineke, L. C., Lloyd, R. E. Diversion of stress granules and P-bodies during viral infection. Virology. 436 (2), 255-267 (2013).
  2. Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase. Trends Biochem Sci. 38 (10), 494-506 (2013).
  3. Vonaesch, P., Campbell-Valois, F. -. X., Dufour, A., Sansonetti, P. J., Schnupf, P. Shigella flexneri modulates stress granule composition and inhibits stress granule aggregation. Cell Microbiol. 18 (7), 982-997 (2016).
  4. Kolobova, E., Efimov, A., et al. Microtubule-dependent association of AKAP350A and CCAR1 with RNA stress granules. Exp Cell Res. 315 (3), 542-555 (2009).
  5. Anderson, P., Kedersha, N. Stress granules: the Tao of RNA triage. Trends in biochemical sciences. 33 (3), 141-150 (2008).
  6. Anderson, P., Kedersha, N. Stressful initiations. J Cell Sci. 115, 3227-3234 (2002).
  7. Mohr, I., Sonenberg, N. Host translation at the nexus of infection and immunity. Cell Host Microbe. 12 (4), 470-483 (2012).
  8. Hu, S., Claud, E. C., Musch, M. W., Chang, E. B. Stress granule formation mediates the inhibition of colonic Hsp70 translation by interferon- and tumor necrosis factor. Am J Physiol Gastointest Liver Physiol. 298 (4), 481-492 (2010).
  9. Barry, E. M., Pasetti, M. F., Sztein, M. B., Fasano, A., Kotloff, K. L., Levine, M. M. Progress and pitfalls in Shigella vaccine research. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (4), 245-255 (2013).
  10. Lanata, C. F., Fischer-Walker, C. L., et al. Global Causes of Diarrheal Disease Mortality in Children. PloS One. 8 (9), 72788 (2013).
  11. Ashida, H., Ogawa, M., et al. Shigella deploy multiple countermeasures against host innate immune responses. Curr Opin Microbiol. 14 (1), 16-23 (2011).
  12. Ashida, H., Ogawa, M., Mimuro, H., Kobayashi, T., Sanada, T., Sasakawa, C. Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system. Curr Opin Immunol. 23 (4), 448-455 (2011).
  13. Kedersha, N., Anderson, P. Mammalian stress granules and processing bodies. Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).
  14. Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria. Nat Re. Micro. 7 (5), 333-340 (2009).

Play Video

Cite This Article
Vonaesch, P., Sansonetti, P. J., Schnupf, P. Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (125), e55536, doi:10.3791/55536 (2017).

View Video