Summary

Иммунофлуоресцентный анализ образования гранулята после бактериальной выделения клеток млекопитающих

Published: July 03, 2017
doi:

Summary

Описывается метод качественного и количественного анализа образования гранулятов стенок в клетках млекопитающих после того, как клетки заражены бактериями и рядом различных стрессов. Этот протокол может быть применен для исследования реакции гранулы клеточного стресса в широком диапазоне хост-бактериальных взаимодействий.

Abstract

Флуоресцентная визуализация клеточных компонентов является эффективным инструментом для исследования взаимодействия хозяев-патогенов. Патогены могут влиять на многие различные особенности инфицированных клеток, включая ультраструктуру органелл, организацию цитоскелетной сети, а также клеточные процессы, такие как образование стресс-гранулы (SG). Характеристика того, как патогенные процессы разрушают хост-процессы, является важной и неотъемлемой частью поля патогенеза. Хотя переменные фенотипы могут быть легко видны, точный анализ качественных и количественных различий в клеточных структурах, вызванных проблемой патогенов, необходим для определения статистически значимых различий между экспериментальными и контрольными образцами. Образование SG является эволюционно консервативным стрессовым ответом, который приводит к антивирусным ответам и уже давно изучается с использованием вирусных инфекций 1 . SG также влияет на сигнальные каскады и может иметь другой, еще неизвестный консек2 . Характеристика этой реакции стресса на патогены, отличные от вирусов, такие как бактериальные патогены, в настоящее время является новой областью исследований 3 . На данный момент количественный и качественный анализ образования СГ еще не используется обычно даже в вирусных системах. Здесь мы опишем простой способ индуцирования и характеризации образования SG в неинфицированных клетках и в клетках, инфицированных цитозольным бактериальным возбудителем, который влияет на образование СГ в ответ на различные экзогенные стрессы. Анализ формирования и состава SG достигается с использованием ряда различных маркеров SG и плагина детектора детектирования ICY, инструмента анализа изображений с открытым исходным кодом.

Introduction

Визуализация взаимодействия хозяин-патоген на клеточном уровне является мощным методом получения информации о патогенных стратегиях и идентификации ключевых клеточных путей. Действительно, патогены могут использоваться в качестве инструментов для определения важных клеточных целей или структур, поскольку патогены развились, чтобы разрушить центральные клеточные процессы как стратегию их собственного выживания или распространения. Визуализация клеточных компонентов может быть достигнута путем рекомбинантного экспрессии флуоресцентно-меченых белков-хозяев. Хотя это позволяет проводить анализ в реальном времени, генерация клеточных линий с специфически меченными протеинами хозяина очень трудоемка и может привести к нежелательным побочным эффектам. Более удобным является обнаружение клеточных факторов с использованием специфических антител, поскольку одновременно можно проанализировать несколько факторов хозяина, и один из них не ограничивается конкретным типом клеток. Недостатком является то, что только статический вид может быть захвачен, поскольку анализ иммунофлуоресценции требует фиксации клетки-хозяинаион. Однако важным преимуществом иммунофлюоресцентной визуализации является то, что она легко поддается количественному и качественному анализу. Это, в свою очередь, может быть использовано для получения статистически значимых различий, чтобы дать новое представление о взаимодействиях хозяина-патогена.

Программы анализа флуоресцентного изображения являются мощными аналитическими инструментами для выполнения 3D и 4D-анализа. Однако высокая стоимость программного обеспечения и его обслуживание делают методы, основанные на бесплатном ПО с открытым исходным кодом, более привлекательными. Тщательный анализ изображений с использованием программного обеспечения для биоанализа ценен, поскольку он обосновывает визуальный анализ и при присвоении статистических значений повышает уверенность в правильности данного фенотипа. Ранее SGs анализировались с использованием бесплатного программного обеспечения ImageJ, что требует ручной идентификации отдельных SG 4 . Здесь мы предлагаем протокол для индукции и анализа клеточного SG-образования в контексте bacС использованием бесплатного программного обеспечения для анализа биоизображений с открытым исходным кодом ICY (http://icy.bioimageanalysis.org). Программное обеспечение для анализа биоизображения имеет встроенную программу обнаружения пятен, которая очень подходит для анализа SG. Он позволяет осуществлять точную настройку процесса автоматического обнаружения в определенных регионах интереса (ROI). Это устраняет необходимость в ручном анализе отдельных SG и устраняет смещение выборки.

Многие экологические стрессы вызывают образование SG, которые представляют собой фазовые плотные цитозольные, непембранные структуры диаметром от 0,2 до 5 мкм в диаметре 5,6 . Этот клеточный ответ эволюционно сохраняется у дрожжей, растений и млекопитающих и возникает, когда глобальный перенос белка ингибируется. Он включает в себя агрегацию застопоренных комплексов инициации трансляции в SGs, которые считаются местами для трансляционно-неактивных мРНК, позволяя избирательный перевод подмножества клеточных мРНК.При удалении стресса растворы SGs и глобальные показатели синтеза белка возобновляются. SG состоят из факторов инициации трансляции элонгации, белков, участвующих в метаболизме РНК, РНК-связывающих белков, а также белков и факторов леса, участвующих в передаче сигналов хозяина 2 , хотя точная композиция может варьироваться в зависимости от применяемого напряжения. Факторы окружающей среды, которые индуцируют образование SG, включают в себя голодное голодание, ультрафиолетовое облучение, тепловой шок, осмотический шок, стресс эндоплазматического ретикулума, гипоксию и вирусную инфекцию 2 , 7 , 8 . Значительный прогресс был достигнут в понимании того, как вирусы индуцируют, а также разрушают образование SG, в то время как мало известно о том, как другие патогены, такие как бактериальные, грибковые или простейшие патогены, влияют на этот ответ на клеточный стресс 1 , 7 .

ShigeLla flexneri – грамотрицательный факультативный цитозольный патоген человека и возбудитель тяжелой диареи или шигеллеза. Шигеллез является основным бременем общественного здравоохранения и ежегодно приводит к 28 000 смертей среди детей в возрасте до 5 лет 9 , 10 . S. flexneri заражает кишечный эпителий и распространяет клетку-клетку путем захвата цитоскелетных компонентов хозяина 11 , 12 . Инфекция эпителия поддерживает репликацию S. flexneri в цитозоле, но инфицированные макрофаги умирают в результате процесса воспаления клеточной смерти, называемого пироптозом. Инфекция приводит к массивному набору нейтрофилов и сильному воспалению, которое сопровождается теплом, окислительным стрессом и разрушением тканей. Таким образом, в то время как инфицированные клетки подвержены внутренним стрессам, вызванным инфекцией, такими как нарушение Гольджи, генотоксический стресс и перекрестная цитоскелетная перегруппировкаС, инфицированные клетки также подвергаются воздействию окружающей среды из-за воспалительного процесса.

Характеристика влияния инфекции S. flexneri на способность клеток реагировать на стрессы окружающей среды с использованием ряда маркеров SG продемонстрировала, что инфекция приводит к качественным и количественным различиям в составе SG 3 . Однако мало известно о других бактериальных патогенах. Здесь мы опишем методологию заражения клеток-хозяев цитозольным патогеном S. flexneri , стресс клеток с различными воздействиями окружающей среды, маркировку компонентов SG и качественный и количественный анализ формирования и состава SG в контексте инфицированных И неинфицированные клетки. Этот метод широко применим к другим бактериальным патогенам. Кроме того, анализ изображений SG-образования может быть использован для инфицирования вирусами или другими патогенами. Он может использоваться для анализа SGОбразование при инфицировании или влияние инфекции на образование SG в ответ на экзогенные стрессы.

Protocol

1. Подготовка бактерий и клеток-хозяев Передача стеклянной крышки на 12 или 14 мм соскальзывает в 24-или 12-луночные планшеты, соответственно, стерильным пинцетом, считая одну лунку на экспериментальное состояние. Стерилизовать их путем УФ-обработки в капюшоне для тканевой культуры в…

Representative Results

Чтобы объяснить и продемонстрировать протокол, описанный в этой рукописи, мы охарактеризовали изображение индуцированных клотримазолом SGs в клетках HeLa, инфицированных или не имеющих цитозольного патогена S. flexneri . Схема схемы представлена ​​на рисун…

Discussion

Описанный здесь протокол описывает индукцию, локализацию и анализ СГ в неинфицированных клетках и клетках, инфицированных цитозольным патогеном S. flexneri, в присутствии или отсутствии экзогенного стресса. Используя бесплатное программное обеспечение для обработки изображений, пр?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

PS является получателем гранта Гран-при Билла и Мелинды Гейтс OPP1141322. PV был поддержан стипендией Швейцарского национального научного фонда «Early postdoc Mobility» и постдокторской стипендией Ру-Кантарини. PJS поддерживается грантом HHMI и ERC-2013-ADG 339579-Decrypt.

Materials

Primary Antibodies
eIF3b (N20), origin goat Santa Cruz sc-16377 Robust and widely used SG marker. Cytosolic staining allows cell delineation. Dilution 1 in 300
eIF3b (A20), origin goat Santa Cruz sc-16378 Same target as eIF3b (N20) and in our hands was identical to eIF3b (N20). Dilution 1 in 300
eIF3A (D51F4), origin rabbit (MC: monoclonal) Cell Signaling 3411 Part of multiprotein eIF3 complex with eIF3b . Dilution 1 in 800
eIF4AI, origin goat Santa Cruz sc-14211 Recommended by (Ref # 13). Dilution 1 in 200
eIF4B, origin rabbit Abcam ab186856 Good stress granule marker in our hands. Dilution 1 in 300
eIF4B, origin rabbit Cell Signaling 3592 Recommended by Ref # 13. Dilution 1 in 100
eIF4G, origin rabbit Santa Cruz sc-11373 Widely used SG marker. (Ref # 13): may not work well in mouse cell lines. Dilution 1 in 300
G3BP1, origin rabbit (MC: monoclonal) BD Biosciences 611126 Widely used SG marker. Dilution 1 in 300
Tia-1, origin goat Santa Cruz sc-1751 Widely used SG marker. Can also be found in P bodies when SG are present (Ref # 13). Dilution 1 in 300
Alexa-conjugated Secondary Antibodies
A488 anti-goat , origin donkey Thermo Fisher A-11055 Cross absorbed. Dilution 1 in 500
A568 anti-goat, origin donkey Thermo Fisher A-11057 Cross absorbed. Dilution 1 in 500
A488 anti-mouse, origin donkey Thermo Fisher A-21202 Dilution 1 in 500
A568 anti-mouse, origin donkey Thermo Fisher A10037 Dilution 1 in 500
A647 anti-mouse, origin donkey Thermo Fisher A31571 Dilution 1 in 500
A488 anti-rabbit, origin donkey Thermo Fisher A-21206 Dilution 1 in 500
A568 anti-rabbit, origin donkey Thermo Fisher A10042 Dilution 1 in 500
Other Reagents
Shigella flexneri Available from various laboratories by request
Tryptone Casein Soya (TCS) broth BD Biosciences 211825 Standard growth medium for Shigella, application – bacterial growth
TCS agar BD Biosciences 236950 Standard growth agar for Shigella, application – bacterial growth
Congo red SERVA Electrophoresis GmbH 27215.01 Distrimination tool for Shigell that have lost the virulence plasmid, application – bacterial growth
Poly L lysine Sigma-Aldrich P1274 Useful to coating bacteria to increase infection, application – infection
Gentamicin Sigma-Aldrich G1397 Selective killing of extracellular but not cytosolic bacteria, application – infection
HEPES Life Technologies 15630-056 PH buffer useful when cells are incubated at room-temperature, application – cell culture
DMEM Life Technologies 31885 Standard culture medium for HeLa cells, application – cell culture
Fetal calf serum Biowest S1810-100 5% supplementation used for HeLa cell culture medium, application – cell culture
Non-essential amino acids Life Technologies 11140 1/100 dilution used for HeLa cell culture medium, application – cell culture
DMSO Sigma-Aldrich D2650 Reagent diluent, application – cell culture
Sodium arsenite Sigma-Aldrich S7400 Potent stress granule inducer (Note: highly toxic, special handling and disposal required), application – stress inducer
Clotrimazole Sigma-Aldrich C6019 Potent stress granule inducer (Note:health hazard, special handling and disposal required), application – stress inducer
PFA Electron Microscopy Scences 15714 4% PFA is used for standard fixation of cells, application – fixation
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 Used at 0.03% for permeabilizationof host cells before immunofluorescent staining, application – permeabilization
A647-phalloidin Thermo Fisher A22287 Dilution is at 1/40, best added during 2ary antibody staining, application – staining
DAPI Sigma-Aldrich D9542 Nucleid acid stain used to visualize both the host nucleus and bacteria, application – staining
Parafilm Sigma-Aldrich BR701501 Paraffin film useful for immunofluorescent staining of coverslips, application – staining
Prolong Gold Thermo Fisher 36930 Robust mounting medium that works well for most fluorophores , application – mounting
Mowiol Sigma-Aldrich 81381 Cheap and robust mounting medium that works well for most fluorophores, application – mounting
24-well cell culture plate Sigma-Aldrich CLS3527 Standard tissue culture plates, application – cell culture
12-mm glass coverslips NeuVitro 1001/12 Cell culture support for immunofluorescent applications, application – cell support
forceps Sigma-Aldrich 81381 Cheap and obust mounting medium that works well for most fluorophores, application – mounting
Programs and Equipment
Prism GraphPad Software Data analysisand graphing program with robust statistical test options, application – data analysis
Leica SP5 Leica Microsystems Confocal microsope, application – image acquisition
Imaris Bitplane Professional image analysis program, application – data analysis
Excel Microsoft Data analysis and graphing program, application – data analysis

References

  1. Reineke, L. C., Lloyd, R. E. Diversion of stress granules and P-bodies during viral infection. Virology. 436 (2), 255-267 (2013).
  2. Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase. Trends Biochem Sci. 38 (10), 494-506 (2013).
  3. Vonaesch, P., Campbell-Valois, F. -. X., Dufour, A., Sansonetti, P. J., Schnupf, P. Shigella flexneri modulates stress granule composition and inhibits stress granule aggregation. Cell Microbiol. 18 (7), 982-997 (2016).
  4. Kolobova, E., Efimov, A., et al. Microtubule-dependent association of AKAP350A and CCAR1 with RNA stress granules. Exp Cell Res. 315 (3), 542-555 (2009).
  5. Anderson, P., Kedersha, N. Stress granules: the Tao of RNA triage. Trends in biochemical sciences. 33 (3), 141-150 (2008).
  6. Anderson, P., Kedersha, N. Stressful initiations. J Cell Sci. 115, 3227-3234 (2002).
  7. Mohr, I., Sonenberg, N. Host translation at the nexus of infection and immunity. Cell Host Microbe. 12 (4), 470-483 (2012).
  8. Hu, S., Claud, E. C., Musch, M. W., Chang, E. B. Stress granule formation mediates the inhibition of colonic Hsp70 translation by interferon- and tumor necrosis factor. Am J Physiol Gastointest Liver Physiol. 298 (4), 481-492 (2010).
  9. Barry, E. M., Pasetti, M. F., Sztein, M. B., Fasano, A., Kotloff, K. L., Levine, M. M. Progress and pitfalls in Shigella vaccine research. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (4), 245-255 (2013).
  10. Lanata, C. F., Fischer-Walker, C. L., et al. Global Causes of Diarrheal Disease Mortality in Children. PloS One. 8 (9), 72788 (2013).
  11. Ashida, H., Ogawa, M., et al. Shigella deploy multiple countermeasures against host innate immune responses. Curr Opin Microbiol. 14 (1), 16-23 (2011).
  12. Ashida, H., Ogawa, M., Mimuro, H., Kobayashi, T., Sanada, T., Sasakawa, C. Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system. Curr Opin Immunol. 23 (4), 448-455 (2011).
  13. Kedersha, N., Anderson, P. Mammalian stress granules and processing bodies. Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).
  14. Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria. Nat Re. Micro. 7 (5), 333-340 (2009).

Play Video

Cite This Article
Vonaesch, P., Sansonetti, P. J., Schnupf, P. Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (125), e55536, doi:10.3791/55536 (2017).

View Video