Análise de imunofluorescência da formação de grânulos de estresse após o desafio bacteriano de células de mamífero
Summary
Descrevemos um método para a análise qualitativa e quantitativa da formação de grânulos de estresse em células de mamíferos após as células serem desafiadas com bactérias e vários estresses diferentes. Este protocolo pode ser aplicado para investigar a resposta do grânulo do estresse celular em uma ampla gama de interações hospedeiro-bacteriana.
Abstract
A imagem fluorescente de componentes celulares é uma ferramenta eficaz para investigar interações hospedeiro-patógeno. Os agentes patogênicos podem afetar muitas características diferentes das células infectadas, incluindo a ultraestrutura orgânica, a organização da rede do citoesqueleto, bem como processos celulares, como a formação de grânulos de estresse (SG). A caracterização de como os patógenos subvertem os processos do hospedeiro é uma parte importante e integral do campo da patogênese. Embora os fenótipos variáveis possam ser facilmente visíveis, a análise precisa das diferenças qualitativas e quantitativas nas estruturas celulares induzidas pelo desafio dos patógenos é essencial para definir diferenças estatisticamente significativas entre amostras experimentais e de controle. A formação de SG é uma resposta de estresse conservada de forma evolutiva que leva a respostas antivirais e tem sido investigada por meio de infecções virais 1 . A formação de SG também afeta as cascatas de sinalização e pode ter outras conseqüências ainda desconhecidas2 . A caracterização desta resposta de estresse a agentes patogênicos que não sejam vírus, como patógenos bacterianos, é atualmente uma área de pesquisa emergente 3 . Por enquanto, a análise quantitativa e qualitativa da formação de SG ainda não é rotineiramente utilizada, mesmo nos sistemas virais. Aqui, descrevemos um método simples para induzir e caracterizar a formação de SG em células não infectadas e em células infectadas com um patógeno bacteriano citosólico, o que afeta a formação de SGs em resposta a vários estresses exógenos. A análise da formação e composição do SG é conseguida utilizando vários marcadores de SG diferentes e o plug-in do detector de pontos da ICY, uma ferramenta de análise de imagens de código aberto.
Introduction
A visualização das interações hospedeiro-patógeno em um nível celular é um método poderoso para obter informações sobre estratégias patogênicas e para identificar caminhos celulares chave. Na verdade, os agentes patogênicos podem ser usados como ferramentas para identificar alvos ou estruturas celulares importantes, pois os agentes patogênicos evoluíram para subverter processos celulares centrais como uma estratégia para sua própria sobrevivência ou propagação. A visualização de componentes celulares pode ser conseguida por proteínas de hospedeiro marcadas fluorescentemente com expressão de forma recombinante. Embora isso permita uma análise em tempo real, a geração de linhas celulares com proteínas hospedeiras especificamente marcadas é altamente laboriosa e pode resultar em efeitos colaterais indesejáveis. Mais conveniente é a detecção de fatores celulares usando anticorpos específicos, porque vários fatores do hospedeiro podem ser analisados simultaneamente e um não está limitado a um tipo de célula particular. Uma desvantagem é que apenas uma visão estática pode ser capturada à medida que a análise de imunofluorescência requer a fixação de célula hospedeiraíon. No entanto, uma vantagem importante da imagem de imunofluorescência é que se presta facilmente a análise tanto qualitativa como quantitativa. Isso, por sua vez, pode ser usado para obter diferenças estatisticamente significativas para fornecer novos conhecimentos sobre interações hospedeiro-patógeno.
Os programas de análise de imagens fluorescentes são poderosas ferramentas analíticas para realizar análises 3D e 4D. No entanto, o alto custo do software e sua manutenção tornam mais atraentes os métodos baseados em software livre de código aberto. A análise cuidadosa da imagem usando o software de bioanálise é valiosa porque sustenta a análise visual e, ao atribuir significados estatísticos, aumenta a confiança na correção de um determinado fenótipo. Anteriormente, os SGs foram analisados usando o software ImageJ gratuito, o que requer a identificação manual de SGs individuais 4 . Aqui fornecemos um protocolo para a indução e análise da formação de SG celular no contexto de bacInfecções teriais usando o software livre de análise de bio-imagem de código aberto ICY (http://icy.bioimageanalysis.org). O software de análise de bio-imagem possui um programa integrado de detectores de pontos que é altamente adequado para análise de SG. Permite o ajuste fino do processo de detecção automatizada em Regiões de Interesse (ROIs) especificadas. Isso supera a necessidade de análise manual de SGs individuais e remove o viés de amostragem.
Muitos estresses ambientais induzem a formação de SGs, que são estruturas citossólicas, não membranosas densas em fase, de 0,2 a 5 μm de diâmetro 5 , 6 . Esta resposta celular é conservada evolutivamente em leveduras, plantas e mamíferos e ocorre quando a tradução global de proteínas é inibida. Envolve a agregação de complexos de iniciação de tradução estancados em SGs, que são considerados lugares de espera para mRNAs ativamente translacionais, o que permite a tradução seletiva de um subconjunto de mRNAs celulares.Após a remoção do estresse, os SGs se dissolvem e as taxas globais de resumo da síntese protéica. Os SGs são compostos de fatores de iniciação da alongamento da tradução, proteínas envolvidas no metabolismo do RNA, proteínas de ligação ao RNA, além de proteínas de andaimes e fatores envolvidos na sinalização celular do hospedeiro 2 , embora a composição exata possa variar dependendo do estresse aplicado. Os fatores ambientais que induzem a formação do SG incluem a inanição de aminoácidos, irradiação UV, choque térmico, choque osmótico, estresse do retículo endoplasmático, hipoxia e infecção viral 2 , 7 , 8 . Muitos progressos foram feitos para entender como os vírus induzem e também subverter a formação do SG, enquanto pouco se sabe sobre como outros agentes patogênicos, como patógenos bacterianos, fúngicos ou protozoários, afetam essa resposta de estresse celular 1 , 7 .
ShigeLla flexneri é um patógeno citossico facultativo gram-negativo dos seres humanos e o agente causador de diarréia grave ou shigelose. A shigelose é um grande fardo para a saúde pública e leva a 28 mil mortes por ano em crianças com menos de 5 anos de idade 9 , 10 . S. flexneri infecta o epitélio colônico e se espalha de célula para célula ao seqüestrar os componentes do citoesqueleto do hospedeiro 11 , 12 . A infecção do epitélio apóia a replicação de S. flexneri no citosol, mas os macrófagos infectados morrem através de um processo inflamatório de morte celular chamado pirotecto. A infecção leva a um recrutamento maciço de neutrófilos e inflamação grave que é acompanhada por calor, estresse oxidativo e destruição tecidual. Assim, enquanto as células infectadas estão sujeitas a estresses internos induzidos por infecção, como a ruptura de Golgi, estresse genotóxico e rearranjo do citoesqueletoS, as células infectadas também são submetidas a estresses ambientais devido ao processo inflamatório.
A caracterização do efeito da infecção por S. flexneri sobre a capacidade das células para responder a estresses ambientais usando uma série de marcadores de SG demonstrou que a infecção leva a diferenças qualitativas e quantitativas na composição SG 3 . No entanto, pouco se sabe sobre outros agentes patogênicos bacterianos. Aqui descrevemos uma metodologia para a infecção de células hospedeiras com o patógeno citossolo S. flexneri , o estressamento de células com diferentes estresses ambientais, a rotulagem de componentes de SG e a análise qualitativa e quantitativa da formação e composição de SG no contexto de infecção E células não infectadas. Este método é amplamente aplicável a outros agentes patogênicos bacterianos. Além disso, a análise de imagem da formação de SG pode ser usada para infecções por vírus ou outros agentes patogênicos. Pode ser usado para analisar SGFormação após a infecção ou o efeito da infecção na formação de SG em resposta a estresses exógenos.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo aqui descrito descreve a indução, localização e análise de SGs em células não infectadas e células infectadas com o patógeno citosólico S. flexneri na presença ou ausência de estresse exógeno. Com o uso de software de imagem livre, os protocolos permitem a análise qualitativa e quantitativa precisa da formação de SG para identificar e abordar de forma estatística as diferenças em determinados fenótipos.
Existem vários passos críticos dentro do protoc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O PS é um destinatário da subvenção do Grand Challenge de Bill e Melinda Gates OPP1141322. O PV foi apoiado por uma bolsa de pós-doutorado da mobilidade pós-doutora da Fundação Nacional da Ciência Nacional da Suíça e uma bolsa de pós-doutorado Roux-Cantarini. O PJS é suportado por uma concessão HHMI e ERC-2013-ADG 339579-Decrypt.
Materials
| Primary Antibodies | |||
| eIF3b (N20), origin goat | Santa Cruz | sc-16377 | Robust and widely used SG marker. Cytosolic staining allows cell delineation. Dilution 1 in 300 |
| eIF3b (A20), origin goat | Santa Cruz | sc-16378 | Same target as eIF3b (N20) and in our hands was identical to eIF3b (N20). Dilution 1 in 300 |
| eIF3A (D51F4), origin rabbit (MC: monoclonal) | Cell Signaling | 3411 | Part of multiprotein eIF3 complex with eIF3b . Dilution 1 in 800 |
| eIF4AI, origin goat | Santa Cruz | sc-14211 | Recommended by (Ref # 13). Dilution 1 in 200 |
| eIF4B, origin rabbit | Abcam | ab186856 | Good stress granule marker in our hands. Dilution 1 in 300 |
| eIF4B, origin rabbit | Cell Signaling | 3592 | Recommended by Ref # 13. Dilution 1 in 100 |
| eIF4G, origin rabbit | Santa Cruz | sc-11373 | Widely used SG marker. (Ref # 13): may not work well in mouse cell lines. Dilution 1 in 300 |
| G3BP1, origin rabbit (MC: monoclonal) | BD Biosciences | 611126 | Widely used SG marker. Dilution 1 in 300 |
| Tia-1, origin goat | Santa Cruz | sc-1751 | Widely used SG marker. Can also be found in P bodies when SG are present (Ref # 13). Dilution 1 in 300 |
| Alexa-conjugated Secondary Antibodies | |||
| A488 anti-goat , origin donkey | Thermo Fisher | A-11055 | Cross absorbed. Dilution 1 in 500 |
| A568 anti-goat, origin donkey | Thermo Fisher | A-11057 | Cross absorbed. Dilution 1 in 500 |
| A488 anti-mouse, origin donkey | Thermo Fisher | A-21202 | Dilution 1 in 500 |
| A568 anti-mouse, origin donkey | Thermo Fisher | A10037 | Dilution 1 in 500 |
| A647 anti-mouse, origin donkey | Thermo Fisher | A31571 | Dilution 1 in 500 |
| A488 anti-rabbit, origin donkey | Thermo Fisher | A-21206 | Dilution 1 in 500 |
| A568 anti-rabbit, origin donkey | Thermo Fisher | A10042 | Dilution 1 in 500 |
| Other Reagents | |||
| Shigella flexneri | Available from various laboratories by request | ||
| Tryptone Casein Soya (TCS) broth | BD Biosciences | 211825 | Standard growth medium for Shigella, application – bacterial growth |
| TCS agar | BD Biosciences | 236950 | Standard growth agar for Shigella, application – bacterial growth |
| Congo red | SERVA Electrophoresis GmbH | 27215.01 | Distrimination tool for Shigell that have lost the virulence plasmid, application – bacterial growth |
| Poly L lysine | Sigma-Aldrich | P1274 | Useful to coating bacteria to increase infection, application – infection |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | Selective killing of extracellular but not cytosolic bacteria, application – infection |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | PH buffer useful when cells are incubated at room-temperature, application – cell culture |
| DMEM | Life Technologies | 31885 | Standard culture medium for HeLa cells, application – cell culture |
| Fetal calf serum | Biowest | S1810-100 | 5% supplementation used for HeLa cell culture medium, application – cell culture |
| Non-essential amino acids | Life Technologies | 11140 | 1/100 dilution used for HeLa cell culture medium, application – cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | Reagent diluent, application – cell culture |
| Sodium arsenite | Sigma-Aldrich | S7400 | Potent stress granule inducer (Note: highly toxic, special handling and disposal required), application – stress inducer |
| Clotrimazole | Sigma-Aldrich | C6019 | Potent stress granule inducer (Note:health hazard, special handling and disposal required), application – stress inducer |
| PFA | Electron Microscopy Scences | 15714 | 4% PFA is used for standard fixation of cells, application – fixation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used at 0.03% for permeabilizationof host cells before immunofluorescent staining, application – permeabilization |
| A647-phalloidin | Thermo Fisher | A22287 | Dilution is at 1/40, best added during 2ary antibody staining, application – staining |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Nucleid acid stain used to visualize both the host nucleus and bacteria, application – staining |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | BR701501 | Paraffin film useful for immunofluorescent staining of coverslips, application – staining |
| Prolong Gold | Thermo Fisher | 36930 | Robust mounting medium that works well for most fluorophores , application – mounting |
| Mowiol | Sigma-Aldrich | 81381 | Cheap and robust mounting medium that works well for most fluorophores, application – mounting |
| 24-well cell culture plate | Sigma-Aldrich | CLS3527 | Standard tissue culture plates, application – cell culture |
| 12-mm glass coverslips | NeuVitro | 1001/12 | Cell culture support for immunofluorescent applications, application – cell support |
| forceps | Sigma-Aldrich | 81381 | Cheap and obust mounting medium that works well for most fluorophores, application – mounting |
| Programs and Equipment | |||
| Prism | GraphPad Software | Data analysisand graphing program with robust statistical test options, application – data analysis | |
| Leica SP5 | Leica Microsystems | Confocal microsope, application – image acquisition | |
| Imaris | Bitplane | Professional image analysis program, application – data analysis | |
| Excel | Microsoft | Data analysis and graphing program, application – data analysis | |
References
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