Los explantes de retina enteras de pollo embriones para Tratamientos electroporación y Reactivos Químicos

La retina es parte del sistema nervioso central y es, con su relativa simplicidad y la arquitectura celular bien caracterizada, un modelo popular para estudiar el desarrollo del sistema nervioso central. El ojo del embrión de pollo es relativamente grande en comparación con el resto del embrión. Por tanto, es de fácil acceso en ovo de manipulaciones experimentales, tales como inyecciones o electroporación, y sirve como una excelente herramienta para adquirir conocimientos sobre las células de la retina y la biología del desarrollo in vivo. A pesar de estas ventajas importantes, la supervivencia de los embriones puede ser baja cuando los experimentos son invasivas como con electroporaciones, inyecciones repetidas, o manipulaciones experimentales combinados.

La electroporación de plásmidos de ADN en el embrión de pollo in ovo es un importante y bien establecida técnica ^1. Permite para el etiquetado de las neuronas, la localización del destino celular, así como tractos neuronales en el centro de nervous sistema y permite ectópico expresión génica para analizar la función de proteínas in vivo. La técnica ha sido utilizada para los estudios de tubo neural ^2, hindbrain ^{3, 4} y la retina. Electroporación de retina embrionaria in ovo tiene algunas dificultades experimentales que están relacionados con la situación in vivo. La posición del ojo, debido a la plegado craneal del embrión, es relativamente cerca del corazón. Esta proximidad aumenta el riesgo de un paro cardíaco después de la electroporación, y el riesgo aumenta con la edad del embrión. Por otra parte, para acceder al ojo, es necesario abrir las membranas embrionarias, aumentando así el riesgo de sangrado, malformaciones y posterior viabilidad reducida. Al probar y optimizar un nuevo plásmido de ADN a menudo sin un resultado fenotípico conocido, estas limitaciones pueden disminuir la eficacia y el poder del método incluso para un experimentalista experimentado. Tal como se presenta en este protocolo, la cultura de la wexplante agujero retinal, que se define como a toda la retina neural con el epitelio de pigmento eliminado, es un método eficaz que complementa el enfoque en ovo.

Inyecciones intraoculares de reactivos químicos son relativamente fáciles de realizar in ovo. Sin embargo, la concentración eficaz y exacta de los reactivos inyectados dentro de la retina neural puede ser difícil de controlar totalmente. El volumen inyectado puede variar debido a las fugas y el sitio exacto de la inyección puede afectar tanto a la distribución del reactivo dentro del ojo y de la difusión a través del cuerpo vítreo. La variabilidad tendrá importantes implicaciones para la interpretación de los resultados cuando es decir, se determina una curva dosis-respuesta para un inhibidor de la enzima; particularmente si el efecto es pequeño y la ventana temporal del efecto es estrecho. Por otra parte, un solo ojo puede ser utilizado de cada embrión cuando se realiza en experimentos in ovo debido a los posibles efectos sistémicos a través del torrente sanguíneosobre el ojo contralateral. Coincidente edad es importante a la hora de estudiar el desarrollo y la variabilidad individual entre tratados y los embriones de control pueden conducir a la variabilidad experimental adicional.

Por estas razones, un ex ovo método basado en explantes de retina de embriones de pollo fue desarrollado, en el que la retina neural puede ser expuesto a un uniforme y controlada condición experimental in vitro. El presente protocolo fue desarrollado en base a protocolos anteriores ^5-9. Explantes de retina de la etapa (st) 20 (días embrionarias [E] 3) a ST31 (E7) embriones de pollo fueron disecados, culta y electroporación con una concentración de ADN plásmido definido o expuestos a un medio que contiene una concentración definida de un reactivo químico. El protocolo que aquí se presenta ha sido implementado con éxito en publicaciones recientes, utilizando varios reactivos químicos diferentes, incluyendo los reguladores de la vía de daño en el ADN, como KU55933, SB 218078 y NSC 109555 ditosylate, y el ciclo celular, tal como Cdk1 / 2 inhibidor III ^10,11.